説明
直鎖状ポリエチレンイミンPEI 25000トランスフェクション試薬は、高電荷カチオン性ポリマーで、負に帯電した核酸分子と容易に結合して複合体を形成し、複合体が細胞内に侵入することを可能にします。このトランスフェクション試薬は、HEK293やCHOなどの細胞において、細胞毒性が低く、トランスフェクション効率が高く、遺伝子発現効率が高い一過性トランスフェクション試薬です。直鎖状PEIトランスフェクション試薬は、HEK-293、HEK293T、CHO-K1、COS-1、COS-7、NIH/3T3、Sf9、HepG2、Hela細胞など、さまざまな細胞株に広く適用できることが検証されています。この試薬は血清含有培地に適合し、核酸を効率的に細胞に導入できます。
仕様
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名前 |
ポリエチレンイミン直鎖 （PEI）MW25000 |
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CAS番号 |
9002-98-6, 26913-06-4 |
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分子式 |
（CH 2 CH 2 NH） n |
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分子量 |
2万5000 |
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外観 |
白色または淡黄色の粉末 |
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融点 |
73 ～ 75 ℃ |
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溶解度 |
熱水、低pHの冷水、メタノール、エタノールに可溶。ベンゼン、エーテル、アセトンには不溶。 |
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構造 |
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配送と保管
本製品は室温で出荷され、粉末は2～8℃で2年間保存できます。原液は2～8℃で3ヶ月間保存できます。
注意事項
1) 調製した PEI 溶液を -20 ºC から取り出して解凍した後は、4 ºC の冷蔵庫で保存できますが、再凍結しないでください。
2) ほとんどの細胞では、DNA 1μgあたり3.0μLのPEIトランスフェクション試薬で高いトランスフェクション効率が得られます。最適化のために、DNA 1μgあたり1.5～4μLの直鎖状PEIトランスフェクション試薬の使用も検討してください。
3) 安全と健康のため、作業時には白衣、使い捨て手袋、ドラフトチャンバーを着用してください。
4) この製品は科学研究目的のみに使用され、人体への使用には適していません。
ストック溶液調製（1 mg/mL）
1. 材料
PEI 25000、Milli-Q®水/注射用水（WFI）または同様の生物学的グレードの水、12 mol/L塩酸（HCl）、10 mol/L水酸化ナトリウム（NaOH）、使い捨て0.1〜0.2 μm PES真空滅菌フィルター、滅菌HDPEまたはポリプロピレン保存ボトル。
2. ストック溶液（1 mg/mL）を調製する
1) 1Lのガラスビーカーに、PEI 25000粉末1gをMilli-Q®超純水または同等の生物学的水900mLに加え、マグネティックスターラーで均一に撹拌して小さな渦を発生させます。
2) 塩酸（12 mol/L）を撹拌しながら滴下し、pHが2.0未満になるまでpHを調整します。
3) ビーカーの上部を覆い、完全に溶解するまで 3 時間かき混ぜます。プロセス全体を通じて pH を 2.0 未満に保ちます。
【ご注意】：溶解できない小さな繊維状の粒子が残っている場合がありますが、これは正常な現象です。
4) 撹拌しながらNaOH（10mol/L）を滴下し、pHが6.9～7.1になるまで調整します。
5) 溶液をメスシリンダーに移し、水を加えて1Lとする。
6) 使い捨ての 0.1～0.2 µm PES 真空フィルターで濾過および滅菌して、1 mg/mL のストック溶液を取得します。
7) 必要に応じて小分けし、-20 °C で保存します。1 年間安定します。
【注意】：保存液は再解凍後、4℃で保存でき、2週間安定しますが、再凍結しないでください。
トランスフェクション手順（6ウェルプレートを例に）
1. 細胞接種：トランスフェクション効率を向上させるために、トランスフェクションの1日前に細胞を接種することが推奨され、トランスフェクション時の細胞密度は70％〜80％が好ましい。
2. DNA-PEI 複合体の調製: 以下のシステムに従って DNA-PEI 核酸トランスフェクション試薬複合体を調製します。
1) 細胞の各ウェルに対して、2 μg のターゲット DNA を 100 μL の無血清培地で希釈し、よく混合して DNA 希釈液を作成します。
[注記]: 無血清希釈液にはOpti-MEMまたはddH2Oが推奨されます。
2) すぐに 5 μL の PEI 25000 トランスフェクション試薬を 100 μL の DNA 希釈液に加え、10 秒間ボルテックスしてよく混ぜます。
3) 室温で10〜25分間インキュベートして、DNA-PEIカチオン核酸トランスフェクション試薬複合体を形成します。
3. トランスフェクトされた細胞：
1) 複合体の形成中に、細胞増殖培地を取り除き、各ウェルに2 mLの新鮮な予熱した完全培地を加えます。
2) DNA-PEI核酸-PEI複合体100μLを細胞に直接加え、培養プレートを振って軽く混ぜます。
3) 37℃、5% CO2インキュベーターで培養すると、トランスフェクション後7時間で導入遺伝子の発現を検出できます。適切な試験時間はご自身で決定してください。
4. 定常回転スクリーニング（オプション）
トランスフェクションから24時間後、細胞を新鮮な増殖培地（細胞を10倍以上に希釈）に継代し、5% CO2インキュベーター内で37℃で一晩培養しました。翌日、トランスフェクション耐性遺伝子に一致するスクリーニング薬剤を添加しました。薬剤耐性クローンは約1～2週間でスクリーニングできます。この期間中、スクリーニング薬剤を含む増殖培地は頻繁に交換する必要があります。
さまざまな細胞培養容器でのトランスフェクション投与量（参考のみ）：
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培養容器 |
表面面積あたり 井戸*(cm2) |
DNA(μg) |
トランスフェクション 試薬(μL) |
希釈培地の容量**(μL) |
メッキ量 中くらい |
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96ウェル |
0.3 |
0.1 |
0.1 |
10 |
100μL |
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48ウェル |
0.7 |
0.2 |
0.3 |
20 |
200μL |
|
24ウェル |
1.9 |
0.5 |
1 |
50 |
500μL |
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12ウェル |
3.8 |
1 |
2 |
50 |
1mL |
|
6ウェル |
10 |
2 |
4 |
100 |
2mL |
|
フラスコ 25cm² |
21 |
4 |
8 |
200 |
4mL |
|
フラスコ75cm² |
58 |
10 |
20 |
500 |
10mL |
引用と参考文献:
[1] Qin J, Cai Y, Xu Z, et al. グレリン受容体におけるアゴニズムと逆アゴニズムの分子メカニズム. Nat Commun. 2022;13(1):300. 2022年1月13日発行. doi:10.1038/s41467-022-27975-9(IF:14.919)
[2] Wang Y, Chen J, Gao WQ, Yang R. METTL14はm6A-YTHDF2依存性メカニズムを介してTHBS1を阻害することにより前立腺腫瘍形成を促進する. Cell Death Discov. 2022;8(1):143. 2022年3月30日発行. doi:10.1038/s41420-022-00939-0(IF:5.241)
文書:
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