I. اصول وسترن بلات
وسترن بلات (WB) یا بلات پروتئینی، یک تکنیک کلاسیک برای تشخیص پروتئین های خاص بر اساس برهمکنش های آنتی ژن-آنتی بادی است که به طور گسترده در زیست شناسی مولکولی، ایمونولوژی و زمینه های مرتبط مورد استفاده قرار می گیرد. مراحل اصلی آن عبارتند از:
- جداسازی پروتئین:
- SDS-PAGE پروتئین های دناتوره شده را بر اساس وزن مولکولی جدا می کند.
- SDS پروتئین ها را با بار منفی یکنواخت می پوشاند و تأثیرات ساختاری را از بین می برد.
- انتقال غشا:
- پروتئین ها از ژل به یک غشاء (مثلا PVDF یا نیتروسلولز) منتقل می شوند.
- تشخیص آنتی بادی:
- آنتی بادی های اولیه به طور اختصاصی به پروتئین هدف متصل می شوند و به دنبال آن آنتی بادی های ثانویه کونژوگه با آنزیم (مانند HRP) که سیگنال قابل تشخیصی مانند نورتابی شیمیایی ایجاد می کنند.
II. گردش کار استاندارد وسترن بلات
| مرحله | رویه های کلیدی | معرف های توصیه شده ( |
| 1. آماده سازی نمونه | استخراج پروتئین با بافر لیز RIPA. PMSF را برای مهار پروتئازها اضافه کنید فعالیت. | سری بافر RIPA Lysis، PMSF |
| 2. تعیین کمیت پروتئین | استفاده از روش BCA (Cat#20200ES) برای کمی سازی؛ بافر رقت استاندارد را با بافر نمونه مطابقت دهید. | کیت های کمی سازی BCA (Cat#20200ES/20201ES) |
| 3. الکتروفورز SDS-PAGE | از ژل های پیش ریخته گری استفاده کنید، با ولتاژ 150 ولت اجرا کنید تا رنگ به کف ژل برسد. | ژل های پیش ساخته، بافر بارگیری SDS-PAGE |
| 4. انتقال و مسدود کردن غشاء | غشا PVDF را فعال کنیدCat#36125ES) با خیساندن در متانول به مدت 1 دقیقه؛ انتقال در 300 میلی آمپر به مدت 60 دقیقه در حمام یخ. بلوک در دمای اتاق (RT) به مدت 1 ساعت یا استفاده از محلول مسدود کننده سریع (Cat#36122ES) به مدت 10 دقیقه | Trبافر ansfer، سری غشایی PVDF |
| 5. جوجه کشی آنتی بادی | یک شبه با آنتی بادی اولیه در دمای 4 درجه سانتیگراد جوجه کشی کنید. آنتی بادی ثانویه در دمای اتاق به مدت 1-2 ساعت؛ با TBST 3 برابر کاملاً بشویید. | رقیق کننده آنتی بادی |
| 6.تشخیص پروتئین | توسعه با ECL (Cat#36208ES). | سری ECL Chemiluminescence |
شکل 1: گردش کار وسترن بلات
III. مسائل و راه حل های رایج
| موضوع | علل احتمالی | راه حل ها |
| پس زمینه بالا  | مسدودسازی ناقص | از محلول مسدود کننده تازه استفاده کنید و زمان مسدود شدن را افزایش دهید. |
| شستشوی ناکافی | برای حذف اتصال غیر اختصاصی، فرکانس و مدت زمان شستشو را افزایش دهید. | |
| غلظت بیش از حد آنتی بادی اولیه | آنتی بادی را به غلظت مناسب رقیق کنید. | |
| نمونه مسائل کیفیت | خلوص و کیفیت نمونه را بررسی کنید. از نمونه های تازه استفاده کنید | |
| خشک کردن غشایی | اطمینان حاصل کنید که غشا در طول مراحل جوجه کشی هیدراته باقی می ماند. از تماس کامل با محلول های واکنش اطمینان حاصل کنید. | |
| سیگنال ضعیف یا بدون سیگنال  | انتقال ناقص | کارایی انتقال را بررسی کنید و زمان را در صورت نیاز تنظیم کنید. |
| غشای PVDF غیرفعال | PVDF را در متانول خیس کنید تا قبل از انتقال به بافر فعال شود. | |
| عدم تطابق آنتی بادی اولیه با گونه های هدف | برگه اطلاعات را بررسی کنید، توالی های ایمونوژن و پروتئین را مقایسه کنید و a به طور گسترده ای از کنترل مثبت استفاده می شود (به عنوان مثال، β-اکتین در سلول های پستانداران). | |
| ناسازگاری آنتی بادی اولیه و ثانویه | اطمینان حاصل کنید که آنتی بادی ثانویه با گونه میزبان آنتی بادی اولیه مطابقت دارد. | |
| اتصال ناکافی آنتی بادی | غلظت آنتی بادی را افزایش دهید و انکوباسیون را در دمای 4 درجه سانتیگراد (مثلاً یک شبه) افزایش دهید. | |
| سطوح پایین آنتی ژن | حداقل 20-30 میکروگرم پروتئین در هر خط بارگیری کنید. از مهارکننده های پروتئاز و کنترل مثبت استفاده کنید. | |
| بیان پروتئین هدف پایین | تأیید بیان در نمونه از طریق ادبیات / پایگاه داده. نمونه را غلیظ کنید یا از یک کنترل با بیان بالا استفاده کنید. | |
| باندهای غیر اختصاصی / باندهای چندگانه  | خطوط سلولی بیش از حد عبور کرده که پروفایل پروتئین را تغییر می دهد | از سلول های کم گذر (کمتر از 15 پاساژ) استفاده کنید و کنترل های موازی را با استوک های گذر اولیه اجرا کنید. |
| تخریب پروتئین | شامل مهارکننده های پروتئاز در بافر لیز. در دمای 80- درجه سانتی گراد نگهداری شود، از یخ زدگی و ذوب شدن خودداری شود، از نمونه های تازه استفاده شود. | |
| اصلاحات پس از ترجمه | ادبیات را برای تغییراتی که بر اندازه نوار تأثیر می گذارد (به عنوان مثال، یوبی کوئیتیناسیون، گلیکوزیلاسیون) بررسی کنید. | |
| انواع اتصال چندگانه | انواع اتصال را از طریق ادبیات یا پایگاه داده تأیید کنید. | |
| دیمر/مولتیمرهای پروتئینی | بتا مرکاپتواتانول یا DTT تازه را به بافر بارگیری SDS اضافه کنید. | |
| آلودگی پروتئینی اگزوژن | پروتئین های اگزوژن را بررسی کنید. در صورت نیاز خطوط سلولی را تغییر دهید. | |
| بارگذاری بیش از حد نمونه | بهینه سازی بارگذاری (20-30 میکروگرم) بر اساس بیان هدف از طریق آزمایش گرادیان. | |
| تشکیل مولتیمر | نمونه ها را به مدت 10 دقیقه بجوشانید تا مولتیمرها جدا شوند | |
| غلظت آنتی بادی اولیه بالا | غلظت و/یا زمان انکوباسیون را کاهش دهید تا از نوارهای اضافی جلوگیری شود. | |
| غلظت آنتی بادی ثانویه بالا | غلظت کمتر و شامل کنترل ثانویه برای کاهش اتصال غیر اختصاصی. | |
| تشخیص پروتئین های گزارش نشده یا اعضای خانواده | مرور ادبیات یا BLAST. از خطوط/بافت های سلولی توصیه شده استفاده کنید. | |
| اگر تأیید شود، ممکن است پروتئین جدیدی کشف کرده باشید! | ||
| گروه های خندان  | مهاجرت سریع، دمای بافر بالا، بارگذاری بیش از حد، بافر کم | مهاجرت آهسته، بافر قبل از خنک شدن، کاهش بار پروتئین، اطمینان از پوشش کامل بافر چاه ها. |
| باندهای اخم  | مشکلات دستگاه (به عنوان مثال، حباب زیر ژل) | تنظیم را برای از بین بردن حباب ها و اطمینان از پلیمریزاسیون یکنواخت ژل تنظیم کنید. |
| باندهای دم  | حلالیت ضعیف نمونه، تخریب، بافر استفاده مجدد | نمونه ها را خوب مخلوط کنید، از نمونه های تازه استفاده کنید، بافر در حال اجرا تازه تهیه کنید. |
| نوارهای دمبلی شکل  | ژل ناهموار پلیمریزاسیون، نمونه های ناخالص | ژل مجدد برای یکنواختی. نمونه ها را قبل از استفاده سانتریفیوژ کنید. |
| باند اسمیر  | بارگذاری بیش از حد، کیفیت ژل ضعیف | کاهش حجم نمونه، بهبود آماده سازی ژل. |
| علائم حباب  | هوای حبس شده در حین انتقال | هنگام مونتاژ ساندویچ انتقال حباب ها را بردارید. |
| لکه های سیاه ناهموار  | محلول مسدود کننده حل نشده، توزیع نابرابر آنتی بادی | محلول مسدود کننده را کاملا حل کنید، 3 بار با TBST بشویید، در طول انکوباسیون هم بزنید. |
| تکه های سفید  | سوبسترای تخلیه کننده غلظت آنتی بادی بالا | غلظت پادتن اولیه/ثانویه پایین تر |
Ⅳ.ابزارهای انتخاب و بهینه سازی محصول
محصولات مرتبط:
| رویه ها | گربه خیر | نام محصول | مشخصات |
| آماده سازی نمونه | 20101ES | بافر لیز RIPA (قوی) | 100 میلی لیتر |
| 20115ES | بافر لیز RIPA (متوسط) | 100 میلی لیتر | |
| 20114ES | بافر لیز RIPA (ضعیف) | 100 میلی لیتر | |
| 20118ES | بافر Lysis برای سنجش WB/IP | 100 میلی لیتر | |
| کیت تعیین کمیت پروتئین BCA (بهبود) | 500 T/2500 T/5000 T | ||
| کیت تعیین کمیت پروتئین BCA (آماده برای استفاده) | 500 ت | ||
| الکتروفورز SDS-PAGE | نشانگر پروتئینی با محدوده منظم 3 رنگ Gold Band Plus (8-180 کیلو دالتون) | 250 میکرولیتر/2×250 میکرولیتر/10×250 میکرولیتر | |
| نشانگر پروتئینی با برد بالا 3 رنگ GoldBand™ (10-245 کیلو دالتون) | 2×250 میکرولیتر/10×250 میکرولیتر | ||
| 20328ES | کیت آماده سازی ژل SDS-PAGE | 1 کیت (30 تا 50 ژل) / 1 کیت (150 تا 250 ژل) | |
| کیت آماده سازی سریع ژل PAGE | غلظت ها: 8٪، 10٪، 12.5٪، 15٪ | ||
| 36259ES-36280ES | ژل Precast Protein Plus | غلظت ها: 8٪، 10٪، 12٪، 4-12٪، 4-20٪ بارگیری گزینه های چاه: 10 چاه، 12 چاه، 15 چاه | |
|
انتقال و مسدود کردن غشاء | غشای PVDF 0.45 میکرومتر (1 رول، 30 سانتی متر × 3 متر) | 1 رول | |
| غشاء PVDF 0.22 میکرومتر (1 رول، 30 سانتی متر × 3 متر) | 1 رول | ||
| جوجه کشی آنتی بادی | 36206ES | رقیق کننده آنتی بادی اولیه و ثانویه برای WB | 100 میلی لیتر / 500 میلی لیتر |
|
تشخیص پروتئین | معرف تشخیص Super ECL | 100 میلی لیتر / 500 میلی لیتر | |
| کیت بستر شیمی‌تابنده پیشرفته ECL | 100 میلی لیتر / 500 میلی لیتر |
V.نحوه دریافت پشتیبانی
برای عیب یابی شخصی یا بهینه سازی پروتکل:
- بازدید از:
Yeasen صفحه محصول وسترن بلات - ایمیل: info@yeasenbio.com
قانون طلایی موفقیت: رویه های استاندارد + معرف های با کیفیت بالا + اعتبار سنجی گام به گام = نتایج قابل تکرار WB!