Die Cap-Struktur ist ein wesentlicher Bestandteil der Entwicklung von mRNA-Impfstoffen und -Therapeutika. Die synthetische mRNA-Technologie nutzt Cap1, um die Stabilität und Translationseffizienz zu verbessern und die Erkennung der mRNA durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und andere Immunsensoren durch das angeborene Immunsystem zu reduzieren. Dadurch wird eine unerwünschte Immunaktivierung minimiert. Dies verhindert unerwünschte Entzündungsreaktionen und verbessert so die Stabilität und Wirksamkeit der therapeutischen mRNA in menschlichen Zellen.
Frühe Entdeckung und Cap0-Struktur
Mitte der 1970er Jahre entdeckte die Forschung an eukaryotischer mRNA eine 5'-terminale Struktur, die heute als Cap0 bekannt ist. Dabei ist eine N7-Methylguanosin-Kappe (m7G) an das erste Nukleotid am 5'-Ende gebunden. Diese Modifikation schützt die mRNA vor dem Abbau durch Exonukleasen, unterstützt den Kernexport und fördert die Ribosomenerkennung für die Translationsinitiation. Cap0 war die erste charakterisierte Kappenstruktur, deren Methylierung auf die Guanosin-Kappe selbst beschränkt war. Die Entdeckung dieser 5'-Kappe und ihrer Funktionen markierte einen bedeutenden Durchbruch im Verständnis eukaryotischer mRNA-Kappen und ihrer Rolle bei mRNA-Modifikationen.
Die Entstehung von Cap1
Die Cap1-Struktur, ein entscheidendes Merkmal eukaryotischer mRNA, spielt eine zentrale Rolle für deren Stabilität, Translation und Immunerkennung. Die mRNA-Cap-Struktur, bestehend aus einem N7-Methylguanosin (m7G), das über eine 5'-5'-Triphosphat-Bindung mit dem ersten Nukleotid verknüpft ist, entwickelte sich aus frühen Studien zu posttranskriptionellen Modifikationen eukaryotischer mRNA in den 1970er Jahren.
Struktur von 5'-endgecappten mRNAs.【1】 Weitere Untersuchungen ergaben, dass in den meisten eukaryotischen mRNAs das erste Nukleotid nach der Cap (Position +1) ebenfalls an der 2'-O-Position der Ribose methyliert ist, ein Vorgang, der als 2'-O-Methylierung bezeichnet wird. Diese als Cap1-Struktur (m7GpppNm) bekannte Entdeckung fügte den mRNA-Modifikationen eine weitere Ebene funktionaler Bedeutung hinzu. Es wurde festgestellt, dass die Cap1-Modifikation die mRNA-Stabilität fein abstimmt und die Immunerkennung durch das angeborene Immunsystem verhindert, insbesondere in Säugetierzellen, wo sie hilft, der Erkennung durch Mustererkennungsrezeptoren wie RIG-I, TLRs und MDA5【2】 zu entgehen. Dies war sowohl für den mRNA-Stoffwechsel als auch für die Weiterentwicklung mRNA-basierter Technologien, einschließlich mRNA-Impfungen und Gentherapieanwendungen, von entscheidender Bedeutung.
Technische Herausforderungen in der mRNA-Industrie und aktuelle Lösungen
Für die breite Anwendung und Optimierung von mRNA-Impfstoffen bestehen weiterhin einige technische Herausforderungen, darunter Probleme mit hochdosierter mRNA, Immunreaktionen, Stabilität und Verabreichung. Eine wesentliche Herausforderung in der mRNA-Industrie ist der Bedarf an hohen mRNA-Dosen, um eine starke Immunreaktion hervorzurufen. Dies ist auf mehrere Faktoren zurückzuführen:
Schneller Abbau: mRNA ist von Natur aus instabil und anfällig für den Abbau durch in biologischen Systemen vorhandene Decapping-Enzyme und Ribonukleasen (RNasen).
Eingeschränkte Translationseffizienz: Die Effizienz der mRNA-Übersetzung in Proteine kann variieren. Um ausreichend Antigenspiegel für eine Immunantwort zu erzeugen, sind höhere mRNA-Mengen erforderlich. Die Translationseffizienz hängt mit der Affinität von Cap1 und dem Translationsinitiationsfaktor eIF4E zusammen.
Die Bildung des grundlegenden Translationsinitiationskomplexes bei Eukaryoten.【3】
Immunogenität und unerwünschte Immunreaktionen: Die dritte größte Hürde ist die angeborene Immunantwort, die durch die mRNA selbst ausgelöst werden kann, insbesondere bei dsRNA oder unvollständiger mRNA. Ein gewisses Maß an Immunaktivierung ist zwar erwünscht, um das adaptive Immunsystem zu stimulieren, eine übermäßige Aktivierung kann jedoch zu Entzündungsreaktionen führen, die die Wirksamkeit des Impfstoffs verringern oder Nebenwirkungen verursachen können.
Geschichte der Verschlusstechnologie
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Enzymatische Capping-Technologie: Das enzymatische Capping, das in den Anfängen der mRNA-Forschung eingeführt wurde, beinhaltet die Verwendung von Capping-Enzymen wie Guanylyltransferase und Methyltransferase, um posttranskriptionell eine natürliche 5'-Kappe hinzuzufügen. Diese Methode gewährleistet eine hohe Genauigkeit und Capping-Effizienz bei der mRNA-Translation, insbesondere für therapeutische Anwendungen.
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Analoga synthetischer Kappen (1980er-2000er Jahre): Forscher entwickelten synthetische Cap-Analoga für die In-vitro-Synthese von gecapter mRNA, um die mRNA-Funktion und Genexpression zu untersuchen. Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) ist ein synthetisches Cap-Analogon, das den fehlerhaften Einbau von Caps während der mRNA-Synthese verhindern und so die Translationseffizienz von mRNA für Impfstoffe und Gentherapien verbessern soll. Die Capping-Effizienz und -Ausbeute des ARCA-Cappings sind jedoch gering.
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Cap1-Technologie (2010er Jahre): Cap1 ist eine ko-transkriptionelle Capping-Methode, die den Prozess vereinfacht, indem die Kappe direkt während der mRNA-Synthese eingebaut wird. Diese Methode steigert die Effizienz und liefert einen hohen Anteil korrekt gecappter mRNA. Damit eignet sie sich ideal für groß angelegte therapeutische Anwendungen wie mRNA-Impfstoffe.
Derzeit sind enzymatische Capping-Technologien von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung mRNA-basierter Therapien, einschließlich COVID-19-Impfstoffen, da sie die Stabilität und effektive Translation therapeutischer mRNA gewährleisten.
Vergleich der enzymatischen Verkappung, der nächsten Generation LZCap Capping und die Capping-Methode der ersten Generation (ARCA)
Entwicklung von Cap-Analoga der nächsten Generation
Unser Ziel war die Entwicklung von Cap-Analoga mit Resistenz gegen Decapping-Enzyme, hoher Affinität zu eIF4E zur Verbesserung der Translationseffizienz und geringerer Immunogenität. Diese Fortschritte sind entscheidend für die Steigerung der Wirksamkeit mRNA-basierter Therapien, einschließlich Krebsbehandlungen und Gentherapieanwendungen.
Entwerfen von LZCap
Bei der Entwicklung von LZCap konzentrierten wir uns hauptsächlich auf die Schaffung eines Cap-Analogons mit hoher Affinität zu eIF4E. Enzyme erkennen Substrate relativ spezifisch. Daher achten wir beim Entwurf einer neuen Cap-Struktur darauf, die Ähnlichkeit mit natürlichen/bekannten Strukturen so weit wie möglich beizubehalten. Die natürliche Struktur besitzt eine Ribose-3'-OH-Gruppe, die modifiziert werden kann (z. B. durch Methylierung). Aus diesem Grund entschieden wir uns für die Hinzufügung eines Kohlenstoffatoms an der 3'-Position, um die Neuheit zu verstärken, gefolgt von einem NH zur Nachahmung der Wasserstoffbrückenbindung von OH und schließlich einer Acetylgruppe, um die Basizität von NH zu verringern und dessen Fähigkeit zur Bildung von Wasserstoffbrücken zu verbessern. Die Aktivität von LZCap ist höher als die von methyliertem natürlichem Cap, möglicherweise aufgrund der erhöhten Wasserstoffbrückenbindung. Im Vergleich zu den Methyl- und Methoxygruppen kann die Acetylaminogruppe auch die Van-der-Waals-Wechselwirkungen zwischen dem Substrat (Cap) und dem initiierenden Faktor (Enzym) erhöhen.
Stabilität der Acetylaminogruppe
Die Acetylaminogruppe ist bereits ausreichend stabil. Sie ist wesentlich stabiler als die 7-Methylposition und die Phosphodiesterbindung, die die am wenigsten stabilen Teile der Kappe sind.
Ertrag und Kappungseffizienz von LZCap
Mit der LZCap AG(3'Acm)-Kappe beträgt die Luciferase-mRNA-Capping-Effizienz etwa 97,59 %, und bis zu 200 μg gecappte mRNA können mit 1 μg DNA-Template in einer Standard-In-vitro-Transkriptionsreaktion (IVT) mit T7-RNA-Polymerase gewonnen werden. Die mRNA-Reinheit beträgt nach einfacher LiCl-Fällung bis zu 99 %. Diese hohe Capping-Effizienz und Ausbeute machen LZCap zu einer attraktiven Option für verschiedene Anwendungen, einschließlich Proteinproduktion und Gentherapie.
Die Cap-Struktur ist ein wesentlicher Bestandteil bei der Entwicklung von mRNA-Impfstoffen und Therapeutika.Die synthetische mRNA-Technologie nutzt Cap1, um die Stabilität und Translationseffizienz zu verbessern und die Erkennung der mRNA durch Toll-like-Rezeptoren (TLRs) und andere Immunsensoren durch das angeborene Immunsystem zu reduzieren. Dadurch wird eine unerwünschte Immunaktivierung minimiert. Dies verhindert unerwünschte Entzündungsreaktionen und verbessert so die Stabilität und Wirksamkeit der therapeutischen mRNA in menschlichen Zellen.
| Produkt | Kappe AG (3'-OMe-7mG) | LZCap AG(3'Acm) | AG (keine Deckelung) |
| mRNA-Ausbeute (μg) | 164 | 173 | 200 |
MS-Analyse der Capping-Effizienz von LZCapped Luciferase mRNA mit der RNAse H-basierten Methode. Die Capping-Effizienz beträgt ca. 97,59 %.
Wie ist die mRNA-Stabilität gegenüber dem Decapping-Enzym?
mRNAs mit LZCap AG (3'Acm) und LZCap AG M6 (3'Acm) zeigen eine höhere Resistenz gegenüber dem Decapping-Enzym (NEB). Es ist zu beachten, dass CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) ebenfalls resistent gegen das Decapping-Enzym ist, während das reguläre Cap AG (3'-OMe-7mG) keine Resistenz zeigt.
Wie ist die Bindungsaffinität von LZCap zu eIF4E?
Wie steht es um die Proteinexpression von mit LZCap AG(3'Acm) gecappter mRNA?
Die Expression von LZCap AG(3'Acm)-gecapter Luciferase-mRNA ist in verschiedenen Zelllinien* (3T3-L1, Hela, JAWs, HEK293T und Huh7) signifikant höher als die von Cap1-analogem (3'-OMe-7mG)-gecaptem mRNA. Das Experiment mit 130 Wiederholungen zeigte eine durchschnittlich etwa 1,5-mal höhere Expression von LZCap AG(3'Acm)-gecapter Luciferase-mRNA als von (3'-OMe-7mG)-gecaptem mRNA. Ähnliche Ergebnisse wurden bei Mäusen beobachtet. Der Proteinexpressionsgrad kann je nach mRNA-Sequenz leicht variieren.
Haben Sie weitere Tierdaten?
Die Expressionseffizienz von LZCap AG(3'Acm) oder LZCap AG(3'FMom) gedeckelten
GLuc-kodierende mRNA zeigt im Vergleich zu CapAG (3'-OMe-7mG)-gekappten mRNAs bei Cynomolgus-Affen und -Schweinen eine höhere In-vivo-Expression.
Wie steht es um die angeborene Immunogenität von mit LZCap AG gecappten mRNAs?
LZCapAG ( 3'Acm )-gecapte mRNAs weisen eine geringe angeborene Immunogenität auf. TLR8, TLR7, IL-1A und B spielen eine wichtige Rolle bei der durch ungeschützte RNA induzierten Immunantwort. In-vivo-Studien zur Immunogenitätsanalyse von LZCap-mRNA zeigten, dass ungeschützte RNA signifikante Veränderungen im Transkriptionsniveau immunrelevanter Faktoren bei Mäusen verursachte. Sowohl LZCap- als auch 3'-OMe-7mG-gecapte mRNAs zeigten nach einer einzigen RNA-stimulierten Injektion ein ähnlich niedriges Transkriptionsniveau von Immunfaktoren bei Mäusen.
Haben Sie einige Sicherheitstests durchgeführt?
Ja, wir haben einen Zytotoxizitätstest, eine Studie zur Hemmung der menschlichen Polymerase und einen Ames-Test durchgeführt.
- Für das Nukleosidmonomer 3'-Acm-7mG (CC50 > 10.000 nM) wurde in den Zellen 293T, Huh7, MRC5, THP1 und U87MG keine oder nur eine geringe Zytotoxizität beobachtet.
- Menschliche DNA-Polymerase (α,β, γ und Klenow) und mitochondrialen RNA-Polymerase (hPOLRMT) Aktivitätshemmungsstudien zeigen, dass 3'-Acm-7mG TP die menschliche DNA- oder RNA-Polymerase nicht hemmt.
- Der bakterielle Rückmutationstest (Ames) weist assoziierte genetische Veränderungen sowie genotoxische Karzinogene bei den meisten Nagetieren und Menschen nach. Der Ames-Test zeigte, dass 3'-Acm-7mG keine Genotoxizität aufweist.
Ist dieses Produkt patentiert?
Ja. Das Patent wurde in den USA erteilt.
Bestellinformationen
| Produktname | Technische Daten | Katalognummer |
| LZCap AG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10684ES |
| LZCap AU(3'Acm)( 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10685ES |
| LZCap GG(3'Acm)（ 100 mM） | 100 μl, 1 ml | 10686ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ 25 mM） | 100 μl, 1 ml | 10688ES |
| LZCap AG(3'Ma-Cy7)( 25 mM） | 100 μl, 1 ml | 10689ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | 10687ES |
| LZCap (AG(3'Ma-Biotin) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Anfrage |
| LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | Anfrage |
| LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 mM) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 μg/μL) | 100 μl, 1 ml | Anfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
| LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) | 100 μl, 1 ml | ICHAnfrage |
Referenz:
- Molekulare Mechanismen der RNA-Capping und Methylierung des Coronavirus, Virologica Sinica 31(1)
- mRNA-Impfstoffe – eine neue Ära in der Vakzinologie. Nat. Rev. Drug. Entdeckung. 17, 261–279 (2018).
- Regulation der Translationsinitiierung durch RNA-bindende Proteine bei Säugetieren: Die Modulation des Translationsinitiierungskomplexes durch Trans-agierende Faktoren, Zellen 2021, 10(7), 1711