ACS Catalysis에 게재됨
루프 매개 등온 증폭(LAMP) 은 간편성, 효율성, 그리고 정밀성으로 유명한 강력한 DNA 증폭 기술입니다. 탁월한 특이성, 민감도, 속도, 그리고 사용 편의성을 갖춘 LAMP는 분자 현장진단(POCT) 분야의 초석이 되었으며, 질병 진단, 유전자 변형 식품 검출 등 다양한 분야에서 혁신을 주도하고 있습니다. 이 기술의 핵심에는 Bst DNA 중합효소가 있습니다. Bst DNA 중합효소는 중합효소 활성, 가닥 치환 능력, 그리고 열 안정성을 아우르는 핵심 효소로서, LAMP 반응의 속도와 정확도를 직접적으로 결정합니다.
Yeasen은 최첨단 형광 활성화 액적 분류(FADS) 기술을 활용하여 70°C 고온 LAMP 분석을 용이하게 하는 내열성 Bst DNA 중합효소를 성공적으로 개발하여 LAMP 분석에서 흔히 발생하는 위양성(false positive) 문제를 해결했습니다. 이 연구는 생촉매 분야의 선도 학술지인 ACS Catalysis (영향력 지수 11.3)에 게재되었습니다.
전체 문서를 보려면 https://doi.org/10.1021/acscatal.4c07614를 방문하세요 .
선구적인 기술과 전문성의 만남
이 효소는 초고처리량 FADS 플랫폼을 통해 개발되었습니다. 이 정교한 시스템은 광학, 전기, 신호 수집 및 미세유체 구성 요소를 통합하며, 액적 생성, 미세주입, 액적 검출 및 분류를 위해 맞춤 설계된 칩을 갖추고 있습니다. 액적 미세유체 기술을 기반으로 하는 FADS 플랫폼은 방대한 돌연변이 라이브러리에 대한 단일 세포 수준의 스크리닝을 가능하게 하며, 매일 1천만 개 이상의 돌연변이를 탁월한 효율로 처리합니다.
그림 1. FADS 초고처리량 효소 스크리닝 플랫폼
a. 시스템은 광원, 신호 발생기, 전압 증폭기, 디지털 전원 공급 장치, 광전자 증배관(PMT), 데이터 수집 카드, 고속 카메라 등 핵심 구성 요소로 구성됩니다.
b. 물방울 생성 칩.
c. 전기장 유도 피코리터 주입 칩.
d. 형광 활성화 물방울 분류 칩.
한편, 예센 바이오텍은 효소 응용 및 변형 분야에 대한 심층적인 전문 지식을 제공했습니다. 연구팀은 FADS 플랫폼에 최적화된 가닥 치환 활성 프로브를 활용하여 Bst DNA 중합효소에 대한 혁신적인 초고처리량 스크리닝 전략을 설계했습니다. 준합리적 설계, 무작위 돌연변이, 그리고 DNA 재조합을 결합하여 단일 세포 수준에서 미세액적에 캡슐화된 돌연변이 라이브러리를 구축했습니다. 세 차례의 엄격한 스크리닝 끝에 M2와 M3라는 두 가지 뛰어난 돌연변이체가 최고의 성능을 발휘하는 것으로 나타났습니다.
그림 2. FADS를 통한 Bst DNA 중합효소 분자 진화의 개략도
a. 다중 부위 포화 돌연변이 라이브러리는 준합리적 설계를 통해 구축되었습니다(다른 색상은 서로 다른 아미노산 돌연변이를 나타냄).
b. 1차 스크리닝에서 양성 돌연변이를 기반으로, 열 안정성을 향상시키기 위해 무작위 돌연변이 라이브러리를 구축했습니다(빨간색 점은 이전 라운드에서 우수한 돌연변이 부위를 나타내고, 다른 색깔 점은 추가 아미노산 돌연변이를 나타냅니다).
c. 두 번째 라운드의 스크리닝에서 나온 돌연변이체에 대해 DNA 재조합을 수행했습니다(빨간색 점은 이전 라운드에서 확인된 고성능 돌연변이 부위를 나타냄).
d. 세 차례의 스크리닝을 거쳐, 열 안정성과 가닥 치환 활성이 향상된 돌연변이체를 성공적으로 분리하였다.
e. 라이브러리를 대장균 BL21(DE3) 세포에 형질전환시켰다. IPTG 유도 후, 각 세포는 고유한 Bst DNA 중합효소 변이체를 발현했다(색상은 돌연변이체의 종류를 나타냄).
f. 개별 세포가 반응 시스템에 캡슐화되었을 때, 프라이머에 있는 소광기로 인해 물방울에서 형광이 나타나지 않았습니다.
g. 용해 시약은 세포 구조를 파괴하여 가닥 치환 반응을 위한 Bst DNA 중합효소를 방출했습니다. 이후 프라이머가 치환되면서 액적에서 형광이 방출되었습니다.
h. 양성 비말은 FADS 분류 시스템에서 풍부해졌습니다.
LAMP 성능 재정의
이러한 돌연변이체를 기반으로, 저희는 놀라운 개선을 보이는 특수 LAMP 반응 시스템을 개발했습니다. 실험 결과, 이 유전자 조작 돌연변이체는 안정적인 55°C에서 특징적인 피크 검출 시간을 35분에서 10분 미만으로 단축하여, 표준 온도 범위에서 널리 사용되는 수입 Bst 2.0 시스템의 반응 속도를 훨씬 능가하는 것으로 나타났습니다. 더욱 인상적인 점은, 이 돌연변이체들이 최대 70°C의 극한 온도에서도 뛰어난 회복성을 보여, 저희 연구진이 고온 LAMP(HT-LAMP) 검출 기술을 개척할 수 있게 되었다는 것입니다. 이 혁신은 기존 LAMP의 오랜 난제인 위양성(false positives)을 해결하여 진단 정확도를 획기적으로 개선하는 솔루션을 제공합니다.
그림 3. FADS 시스템 구축 및 심사 프로세스
a. 마이크로반응기에서 다양한 시간대에 배양된 세포의 명시야 및 형광 이미지.
b. 야생형(WT) 및 돌연변이 라이브러리를 발현하는 마이크로반응기의 명시야 및 형광 이미지(30분 동안 배양).
c. 첫 번째 진화 라운드에서 양성 균주가 풍부해졌습니다.
d. 두 번째 진화 과정에서 양성 균주가 풍부해졌습니다.
e. 세 번째 진화 라운드에서 양성 균주가 풍부해졌습니다.
획기적인 발전은 여기서 끝나지 않았습니다. 연구팀은 이렇게 강화된 Bst DNA 중합효소 돌연변이체를 기반으로 동결건조 LAMP 시약도 개발했습니다. 야생형 효소와 비교했을 때, 이 돌연변이체는 시약 보관 안정성을 두 자릿수(zero)까지 향상시켜 50°C의 가속 조건에서도 6개월 이상 활성을 유지했습니다. 이러한 발전은 진화된 Bst DNA 중합효소를 LAMP 기반 응용 분야에서 막대한 잠재력을 가진 상업적으로 실행 가능한 핵심 효소로 자리매김했습니다.
그림 4. LAMP 검출에서 Bst DNA 중합효소 돌연변이체의 성능
a. 다양한 온도에서 LAMP 검출에 있어서 Bst DNA 중합효소 돌연변이체의 성능.
b. NEB의 Bst DNA 중합효소(녹색)와 비교했을 때, 돌연변이체 M2(주황색)와 M3(빨간색)는 다양한 표적에 대해 서로 다른 온도에서 유의미하게 높은 활성을 보였습니다.
c. 거짓 양성 실험에서 돌연변이 M2의 성능.
d. 거짓 양성 실험에서 돌연변이 M3의 성능.
e. 50°C에서 열 가속 시험에서 Bst DNA 중합효소 돌연변이체의 성능.
새로운 통찰력을 얻으세요
연구진은 실용적인 응용 분야를 넘어, 돌연변이체의 우수한 성능 이면에 숨겨진 분자 메커니즘을 탐구했습니다. 분석 결과, 가닥 치환 활성을 향상시키는 새로운 메커니즘이 발견되었고, 이는 "소수성 블레이드" 가설의 제시로 이어졌습니다. 이 발견은 Bst DNA 중합효소를 더욱 최적화하는 이론적 토대를 마련하여 미래 혁신의 길을 열어줄 것입니다.
그림 5. Bst DNA 중합효소의 구조 분석
a. Bst DNA 중합효소의 하부 구조에 대한 그림으로, 템플릿과 프라이머에 따른 구조적 위치를 보여줍니다(PDB: 3TAN).
b. N204R 돌연변이 전후의 구조적 변화.
c. I359L 돌연변이 전후의 구조적 변화.
d. F445I 돌연변이 전후의 구조적 변화.
e. E461K와 N462K 돌연변이 전후의 구조적 변화.
f. D428K와 Y429W 돌연변이 전후의 구조적 변화.
효소 진화의 도약
본 연구는 초고처리량 액적 스크리닝을 Bst DNA 중합효소 진화에 성공적으로 적용한 최초의 사례입니다. 그 결과 생성된 고활성 돌연변이체는 LAMP 반응 시간을 획기적으로 단축하고, 효소의 열안정성을 향상시키며, 시약의 장기적인 안정성을 보장하여 야생형 효소를 상업적으로 가치 있는 자산으로 탈바꿈시켰습니다. 이러한 성과는 분자 효소 진화에 있어 FADS 기술이 지닌 혁신적인 잠재력을 강조합니다.
연구에서 현실로
이 연구를 바탕으로 Yeasen Biotech는 열안정성 DNA 중합효소인 Hieff Super Bst DNA 중합효소(2,000 U/μL, Cat#14410) 를 시장에 출시했습니다 . 이 제품은 현재 산업 및 연구용으로 이용 가능합니다. 이 제품의 잠재력을 알아보고 싶으신가요? 지금 바로 연락하셔서 제품 시험 사용을 시작해 보세요!