Ct 값은 형광 정량 PCR에서 중요한 결과 표현 방식입니다. 유전자 발현 수준이나 유전자 복제 수의 차이를 계산하는 데 사용됩니다. 그렇다면 형광 정량에서 어느 정도의 Ct 값이 합리적이라고 할 수 있을까요? Ct 값이 유효 범위 내에 있는지 어떻게 확인할 수 있을까요? 오늘 Xiao Yi가 이 질문에 대한 답을 직접 알려드리겠습니다.
Ct 값은 무엇입니까?
qPCR 증폭 과정에서 Ct 값은 증폭된 산물의 형광 신호가 설정된 형광 역치에 도달하는 증폭 사이클 횟수(Cycle Threshold)를 나타냅니다. "C"는 Cycle을, "T"는 Threshold를 의미합니다. 간단히 말해, Ct 값은 qPCR에서 시작 템플릿이 특정 양의 산물에 도달하는 데 걸리는 사이클 횟수이며, 이에 대해서는 나중에 자세히 설명합니다.
Ct 값의 기능은 무엇입니까?
1. 지수 증폭, 템플릿 양 및 Ct 값 간의 관계
이상적인 시나리오에서 qPCR 동안 유전자는 기하급수적으로 증폭되어 특정 사이클 횟수에 걸쳐 축적됩니다. 증폭 사이클 횟수와 생성물의 양 사이의 관계는 다음과 같이 표현할 수 있습니다. 증폭된 생성물의 양 = 초기 주형의 양 × (1 + En)^사이클 횟수. 그러나 qPCR 반응이 항상 이상적인 조건에서 발생하는 것은 아닙니다. 증폭된 생성물의 양이 "특정 생성물의 양"에 도달하면, 이 시점에서의 사이클 횟수가 Ct 값이 되며, 이는 기하급수적 증폭 기간을 나타냅니다. Ct 값과 초기 주형의 양 사이의 관계는 다음과 같습니다. 주형의 Ct 값과 해당 주형의 초기 복제 수의 대수 사이에는 선형 관계가 있습니다. 초기 주형의 농도가 높을수록 Ct 값은 낮아지고, 초기 주형의 농도가 낮을수록 Ct 값은 높아집니다.
2. 증폭 곡선, 형광 임계값 및 특정 제품 수량
qPCR 증폭 산물의 양은 형광 신호 형태로 직접 표현되며, 이를 증폭 곡선이라고 합니다. PCR 초기 단계에서는 증폭이 이상적인 조건에서 이루어지고 사이클 횟수가 적을 때 산물의 축적이 최소화되어 생성된 형광 수준이 배경 형광 노이즈와 크게 구별되지 않습니다. 이후 형광 생성은 지수 함수적 단계에 진입합니다. PCR 반응이 지수 함수적 단계에 진입하는 특정 시점, 즉 "특정 산물의 양"에서 PCR 산물의 양을 검출할 수 있으며, 이를 "특정 산물의 양"이라고 합니다. 이를 이용하여 주형의 초기 함량을 추정할 수 있습니다. 따라서 특정 산물의 양에 해당하는 형광 신호 강도를 형광 역치라고 합니다.
PCR의 후반 단계에서는 증폭 곡선이 더 이상 지수적 증폭을 보이지 않고 선형 단계와 평탄 단계로 들어갑니다.
3. Ct 값의 재현성
PCR 사이클이 Ct 값이 나타나는 사이클 수에 도달하면, 진정한 지수 증폭 단계에 진입하는 것입니다. 이 시점에서는 사소한 오류는 증폭되지 않았으므로 Ct 값의 재현성이 매우 뛰어납니다. 즉, 동일한 템플릿을 다른 시간에 증폭하든, 동시에 다른 튜브에서 증폭하든 얻은 Ct 값은 일정하게 유지됩니다. 
Ct 값의 범위는 무엇입니까?
1. 증폭 효율 En
PCR 증폭 효율은 중합효소가 표적 유전자를 증폭 산물로 변환하는 효율을 나타냅니다. 한 DNA 분자가 두 개의 DNA 분자로 변환될 때 증폭 효율은 100%입니다. 증폭 효율은 일반적으로 En으로 표시됩니다. 이후 논문에서 분석의 편의를 위해 증폭 효율에 영향을 미치는 요인들을 간략하게 소개합니다.
| 영향 요인 | 설명 | 판단 |
| A. PCR 억제제 | 1. 템플릿 RNA에는 단백질이나 세제 등 PCR 반응을 억제하는 물질이 포함되어 있을 수 있습니다. 2. 역전사 후 얻은 cDNA에는 템플릿 RNA와 역전사 시약 성분이 고농도로 포함되어 있을 수 있으며, 이는 이후의 PCR을 저해할 수도 있습니다. |
1. 오염 여부는 A260/A280 및 A260/A230 비율을 측정하거나 RNA 전기영동을 수행하여 평가할 수 있습니다. 2. 역전사 후 cDNA가 특정 비율로 희석되는지 여부. |
| 나. 불합리한 프라이머 디자인 | 프라이머는 효과적으로 어닐링할 수 없습니다. | 프라이머에 다이머나 헤어핀 구조가 있는지, 그리고 불일치가 있는지 확인하세요. 때로는 인트론에 걸친 디자인에 주의를 기울여야 할 수도 있습니다. |
| C. 부적절한 반응 절차 | 1. 프라이머가 효과적으로 어닐링될 수 없습니다. 2. DNA 중합효소의 활동이 완전히 방출되지 않습니다. 3. 장시간 고온으로 인해 DNA 중합효소의 활동이 감소합니다. |
1. 어닐링 온도는 프라이머의 Tm 값보다 높습니다. 2. 사전 변성 시간이 너무 짧습니다. 3. 반응 프로토콜의 각 단계의 지속 시간이 너무 깁니다. |
| D. 시약이 완전히 혼합되지 않았거나 피펫팅 오류가 발생했습니다. | 반응 시스템에서 PCR 반응 성분의 국소 농도가 너무 높거나 고르지 않아 PCR이 지수적으로 증폭되지 않습니다. | / |
| E.앰플리콘 길이 | 앰플리콘 길이가 너무 길어서 300개 염기쌍을 초과하여 증폭 효율이 낮아집니다. | 앰플리콘 길이가 80개 염기쌍에서 300개 염기쌍 사이인지 확인하세요. |
| F. qPCR 시약의 영향 | 시약 속 DNA 중합효소 농도가 낮거나 완충액 속 이온 농도가 최적이 아니면 Taq 효소가 최대 활성에 도달하지 못합니다. | 표준 곡선은 프라이머의 증폭 효율을 측정하는 데 사용됩니다. |
2. Ct 값의 범위
Ct 값의 범위는 15~35입니다. 15 미만의 Ct 값은 기준선 단계 내에 있으며 형광 역치에 도달하지 않은 것으로 간주됩니다. 이상적으로 Ct 값과 주형의 초기 복제 수의 대수 사이에는 선형 관계가 있는데, 이를 표준 곡선이라고 합니다. 표준 곡선을 사용하여 증폭 효율이 100%일 때 유전자의 단일 복제 수를 정량화하기 위한 Ct 값은 약 35로 계산됩니다. Ct 값이 35보다 크면 이론적으로 주형의 초기 복제 수가 1보다 작아 통계적으로 유의하지 않은 것으로 간주될 수 있습니다. 
다양한 유전자의 경우, 유전자 사본의 초기 템플릿 양과 증폭 효율의 차이로 인한 Ct 값 범위가 있으므로, 유전자의 선형 감지 범위를 계산하기 위해 해당 유전자에 대한 표준 곡선을 작성해야 합니다.
3. Ct 값에 영향을 미치는 요인
증폭 사이클 횟수와 증폭산물 양 사이의 관계에서 알 수 있듯이, 증폭산물 양 = 초기 템플릿 양 × (1 + En)^사이클 횟수입니다. 이상적인 조건에서 초기 템플릿 양과 En은 Ct 값에 영향을 미칩니다. 템플릿 품질이나 증폭 효율의 차이는 Ct 값을 너무 높게 또는 너무 낮게 만들 수 있습니다.
4. Ct 값이 너무 높거나 너무 낮음
샤오 이는 당사 기술 부서의 전문가와 협의하여 Ct 값과 관련된 두 가지 일반적인 문제에 대한 원인과 해결책을 요약하여 독자들에게 알려드렸습니다.
| 문제 | 원인 | 솔루션 |
| Ct 값이 너무 높습니다 | 템플릿 농도가 낮거나 PCR 억제제가 존재합니다. 증폭 효율이 낮습니다. |
1. 템플릿 농도를 높이거나, RNA 또는 cDNA의 희석 비율을 높이거나, 템플릿을 다시 준비합니다. 2. 어닐링 온도를 낮추거나 2단계 증폭 방법을 사용하세요. 구성 요소와 시스템이 완전히 혼합되었는지 확인하세요. 반응 프로토콜을 최적화하세요. 또는 시약을 교체해보세요. |
| Ct 값이 너무 낮습니다 | 1. 높은 템플릿 농도 2. NTC(No Template Control) 및 NRC(No Reverse Control)의 오염 3. 부적절한 프라이머 디자인 |
1. 템플릿 RNA의 양을 줄이거나 cDNA를 더 높은 비율로 희석합니다. 2. 모든 시약을 새로 교체하거나 UDGase 오염 방지 시약을 사용하세요. 3. 비특이적 증폭을 피하기 위해 절차를 최적화합니다. |
이것으로 이 문제의 원인인 비정상적인 Ct 값에 대한 분석이 완료되었습니다. 다음으로, Xiao Yi가 여러분의 실험 데이터의 정확성과 신뢰성을 보장하기 위해 다양한 가성비 좋은 제품을 추천해 드리겠습니다. 마음에 드는 제품을 골라보세요!