생물학에서 텔로미어와 프로텔로머라아제를 떠올리면, 사람들은 흔히 피할 수 없는 자연 현상인 노화를 먼저 떠올립니다. 텔로미어는 진핵생물 염색체 말단에 위치한 반복적인 DNA 서열로, 염색체의 온전성을 유지하고 세포 분열 주기를 조절하는 역할을 합니다.
프로텔로머라제는 텔로미어를 연장하는 역전사 DNA 합성 효소입니다. RNA와 단백질로 구성된 핵단백질입니다. 단백질 성분은 RNA 성분과 함께 텔로미어 반복 서열의 합성을 촉진할 수 있습니다.
그림 1. 프로텔로머레이즈 매개 텔로미어 확장 기전 [1]
프로텔로머라제는 텔로미어를 복구하고 길이를 연장하며, DNA 복제 결함을 보완하고, 세포 분열 중 텔로미어 손실을 방지하며, 세포 분열 횟수를 증가시킬 수 있습니다. 2009년 노벨 생리의학상은 엘리자베스 H. 블랙번, 캐럴 W. 그라이더, 잭 W. 쇼스택에게 "세포 기능과 노화에서 텔로미어와 프로텔로머라제의 중요한 역할을 규명"한 공로로 수여되었습니다.
오늘은 독특한 프로텔로머라제인 TelN proProtelomerase를 소개하고자 합니다. TelN 프로텔로머라제는 박테리오파지 N15에서 유래하며, N15 복제 시스템의 구성 요소로서 선형 프로파지 DNA 생성에 관여합니다. 진핵생물의 프로텔로머라제와 달리, TelN은 RNA 성분이 없는 순수 단백질 효소입니다. 절단-결찰 활성을 가지고 있으며, 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 절단한 후 절단 부위에 공유 결합으로 닫힌 말단을 남깁니다.
그림 2. TelN 프로텔로머라제 절단 부위
TelN 프로텔로머라 제 작용 기전
TelN 프로텔로머라제의 인식 부위는 56 bp 길이의 팔린드롬 서열이며, 양쪽에 telR과 telL이 있습니다. 표적 서열의 중심 위치 또한 팔린드롬 서열인 telO입니다. TelN 프로텔로머라제는 telO 서열 내부를 절단하여 절단 말단에서 공유 결합으로 닫힌 헤어핀 구조를 형성합니다. 절단 후 DNA 말단은 여전히 telR과 telL로 구성되어 있으며, 이를 도기본 DNA(dbDNA)라고 합니다.
그림 3. TelN 부위에서의 프로텔로머라제 절단 메커니즘 [2]
TelN Protelomerase의 특수 효소 절단-결찰 활성 덕분에, 원형 플라스미드 DNA는 단일 단계 효소 반응을 통해 선형 공유 결합으로 닫힌 덤벨 모양 분자로 전환될 수 있습니다. 선형 열린 DNA 분자와 비교하여 선형 닫힌 DNA는 세포 내 단백질 발현 수준이 더 높아 안정성이 높고 외래 서열이 최소화된 선형 닫힌 말단 미니 DNA를 구축하는 데 매우 적합합니다. 플라스미드 DNA는 mRNA 백신, DNA 백신, 세포 유전자 치료의 핵심 요소로서 중요한 역할을 합니다. 기존 플라스미드 생산 방식은 대장균 발효 및 다단계 증폭을 포함하며, 발효 과정의 통제 불가능한 위험은 고품질 플라스미드 수율을 제한하여 백신 생산 능력을 제한하는 주요 원인이 됩니다. 영국의 Touchlight 회사는 혁신적인 dbDNA 기술을 출시했습니다. 이 기술은 플라스미드 DNA 제조를 위해 기존의 박테리아 발효 방식을 혁신하고, 체외 효소 DNA 합성을 대체합니다. TelN Protelomerase의 특수 효소 절단-결찰 활동은 또한 상기 방법에서 선형 폐쇄형 미니 DNA를 생성하는 데 사용됩니다.
DNA 효소 합성에 있어서 TelN Protelomerase의 응용
phi29 DNA 중합효소와 TelN 프로텔로머라제에 기반한 DNA 시험관 내 효소법은 생물학적 발효 과정에서 발생할 수 있는 여러 가지 통제 불가능한 위험을 피할 수 있으며, 빠른 속도와 높은 수율로 DNA를 합성할 수 있습니다. 합성된 DNA는 mRNA 백신, DNA 백신, 유전자 치료 벡터, 유전자 편집 등 다양한 신기술에 활용될 수 있습니다.
그림 4. DNA 효소 합성의 흐름도 [3]
효소 DNA 합성 과정
- 템플릿 변성
원형 플라스미드 DNA 템플릿은 변성 과정을 통해 두 개의 단일 가닥 원형 DNA로 변환됩니다.
- 롤링 서클 증폭
Phi29 DNA 중합효소와 단일 가닥 원형 DNA를 사용하여 롤링 서클 증폭을 수행하여 프로텔로머라제 인식 서열 간격을 가진 긴 선형 이중 가닥 연쇄 DNA를 생성했습니다.
- 절단 및 공유 결합 폐쇄
TelN 프로텔로머라제는 텔로미어 복합체의 DNA에 있는 telRL을 인식하고, 절단-결찰 활동을 수행하여 공유 결합으로 연결된 선형 DNA 단량체를 생성합니다.
- 박테리아 백본 DNA 제거
제한효소(제한효소) 또는 엑소뉴클레아제(제한효소)는 말단이 열린 구조를 가진 박테리아 골격 DNA를 분해하여 표적 유전자 발현 요소만 포함하는 DNA를 얻습니다. DNA 효소 합성 기술은 생물학적 발효 과정을 생략하고 GMP 수준의 플라스미드 DNA 합성을 신속하게 달성하여 유전자 치료 및 mRNA 백신 분야의 생산 능력 한계를 해결합니다. 산업화에 대한 막대한 잠재력을 가지고 있습니다. YEASEN Biology는 DNA 효소 합성 기술 개발을 촉진하기 위해 phi29 DNA 중합효소(14404ES) 및 TelN 프로텔로머라제(14540ES)와 같은 DNA 효소 합성 핵심 효소 물질을 제공하여 DNA 효소 합성 기술의 연구 및 생산을 지원합니다.
YEASEN의 TelN Protelomerase 성능 발표
- 절단-결찰 성능이 매우 뛰어나며, 이는 수입 브랜드와 동등 수준입니다.
TelN 프로텔로머라제 인식 부위를 포함하는 초나선 플라스미드를 주형으로 사용하여, YEASEN과 브랜드 A의 기울기 첨가(0.078-5 U) 효소를 첨가했습니다. 초나선 플라스미드 0.5 μg을 폐쇄형 선형 이중가닥 DNA(dsDNA)로 전환했습니다. 겔 전기영동을 통해 전환 효율을 측정한 결과, YEASEN의 TelN 프로텔로머라제의 절단 및 연결 활성이 브랜드 A와 동일한 것으로 나타났습니다.
그림 5. TelN M:Marker, C: supercoiled plasmid control의 프로텔로머라제 절단 활성 검출
- 선형 dsDNA의 폐쇄 무결성 > 90%
TelN 프로텔로머라제 인식 부위를 포함하는 초나선 플라스미드를 주형으로 사용하여, YEASEN의 TelN 프로텔로머라제와 브랜드 A를 첨가하고, 초나선 플라스미드 0.5 μg을 폐쇄된 선형 dsDNA로 전환한 후, T5 엑소뉴클레아제를 첨가하여 밴드 분해 정도를 통해 말단 완전성을 측정했습니다. 그 결과, YEASEN의 TleN 프로텔로머라제가 생성한 dsDNA 말단 완전성은 90% 이상으로 브랜드 A와 동일한 수준이었습니다.
그림 6. TelN 프로텔로머라제 말단 폐쇄 무결성 검사. C1: TelN 인식 부위를 포함하고 TelN 프로텔로머라제는 포함하지 않는 플라스미드; C2: TelN 인식 부위를 포함하고 TelN 프로텔로머라제는 포함하고 T5 엑소뉴클레아제는 포함하지 않는 플라스미드; 플라스미드: TelN 인식 부위를 포함하는 플라스미드.
DNA 효소 합성 관련 제품
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제품 분류 |
제품명 |
카탈로그 번호 |
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프로텔로머라제 |
14540ES |
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파이29 DNA 중합효소 |
14404ES |
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엑소뉴클레아제 |
14525ES |
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14538ES |
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리가제 |
10301ES |
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디엔티피(dNTP) |
11867ES |
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디엔티피(dNTP) |
dNTP 혼합물(50mM) |
16932ES(문의) |
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랜덤 프라이머 |
17293ES |
참고 문헌
[1] Giardini MA, Segatto M, da Silva MS, Nunes VS, Cano MI. 텔로미어와 프로텔로머라제 생물학. Prog Mol Biol Transl Sci. 2014;125:1-40.
[2] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 원핵생물의 절단-결합 효소인 TelN에 의해 생성된 선형 폐쇄형 미니 DNA는 포유류 세포에서 기능합니다. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654.
[3] Heinrich J, Schultz J, Bosse M, Ziegelin G, Lanka E, Moelling K. 원핵생물의 절단-결합 효소인 TelN에 의해 생성된 선형 폐쇄형 미니 DNA는 포유류 세포에서 기능합니다. J Mol Med (Berl). 2002;80(10):648-654. doi:10.1007/s00109-002-0362-2.