Ct値は蛍光定量PCRにおいて重要な結果指標であり、遺伝子発現レベルや遺伝子コピー数の差を計算するために使用されます。では、蛍光定量においてCt値はどの程度の範囲であれば妥当と言えるのでしょうか？Ct値が有効な範囲内に収まっていることをどのように保証できるでしょうか？今日は、Xiao Yiが皆さんに代わってこの疑問にお答えします。
Ct値とは何ですか？
qPCR増幅プロセスにおいて、Ct値とは、増幅産物の蛍光シグナルが設定された蛍光閾値に達する増幅サイクル数（サイクル閾値）を指します。「C」はサイクル、「T」は閾値を表します。簡単に言えば、Ct値とは、qPCRにおいて開始テンプレートが一定量の産物に達するのに必要なサイクル数です。これについては後ほど詳しく説明します。
Ct値の機能は何ですか?
1. 指数関数的増幅、テンプレート量、Ct値の関係
理想的なシナリオでは、qPCR中、遺伝子は指数関数的に増幅され、一定数のサイクルを経て蓄積されます。増幅サイクル数と産物量の関係は、増幅産物量 = 初期テンプレート量 × (1 + En) ^ サイクル数で表されます。しかし、qPCR反応は常に理想的な条件下で起こるとは限りません。増幅産物量が「ある産物量」に達した時点でのサイクル数がCt値となり、指数関数的増幅の期間を示します。Ct値と初期テンプレート量の関係は、テンプレートのCt値とそのテンプレートの初期コピー数の対数との間に直線関係があることです。初期テンプレートの濃度が高いほどCt値は低くなり、初期テンプレートの濃度が低いほどCt値は高くなります。
2.増幅曲線、蛍光閾値、および特定の生成物量
qPCR増幅産物の量は、蛍光シグナルの形で直接表され、増幅曲線と呼ばれます。PCRの初期段階、つまり増幅が理想的な条件下にあり、サイクル数が少ない場合、産物の蓄積は最小限で、生成される蛍光レベルは背景の蛍光ノイズと明確に区別できません。その後、蛍光の生成は指数関数的段階に入ります。反応が指数関数的段階に入るちょうどその時点でPCR産物の量を検出でき、これを「一定量」と呼びます。これは、鋳型の初期含有量を推定するために使用できます。したがって、一定量に対応する蛍光シグナル強度は蛍光閾値と呼ばれます。
PCR の後期段階では、増幅曲線は指数関数的な増幅を示さなくなり、線形段階およびプラトー段階に入ります。
3.Ct値の再現性
PCRサイクルがCt値が発生するサイクル数に達すると、真の指数関数的増幅段階に入ります。この時点では、微細なエラーは増幅されていないため、Ct値の再現性は良好です。つまり、同じテンプレートを異なるタイミングで増幅しても、異なるチューブで同時に増幅しても、得られるCt値は一定です。 
Ct値の範囲はどのくらいですか?
1.増幅効率En
PCR増幅効率とは、ポリメラーゼが標的遺伝子を増幅産物に変換する効率を指します。1分子のDNAが2分子のDNAに変換されるとき、増幅効率は100%です。増幅効率は一般的にEnと表記されます。以降の記事での分析の便宜上、増幅効率に影響を与える要因について簡単に説明します。
| 影響要因 | 説明 | 判断 |
| A. PCR阻害剤 | 1. テンプレート RNA には、タンパク質や洗剤など、PCR 反応を阻害する物質が含まれている場合があります。 2. 逆転写後に得られた cDNA には、高濃度のテンプレート RNA と逆転写試薬の成分が含まれている可能性があり、これも後続の PCR を阻害する可能性があります。 |
1. 汚染の存在は、A260/A280 比と A260/A230 比を測定するか、RNA 電気泳動を実行することによって評価できます。 2. 逆転写後、cDNAが一定の割合で希釈されているかどうか。 |
| B. 不合理なプライマー設計 | プライマーは効果的にアニールできません。 | プライマーにダイマーやヘアピン構造があるかどうか、また不一致があるかどうかを確認します。場合によっては、イントロンにまたがる設計に注意を払う必要があります。 |
| C.不適切な反応手順 | 1. プライマーが効果的にアニールできません。 2. DNAポリメラーゼの活性が十分に発揮されない。 3. 高温が長時間続くと、DNAポリメラーゼの活性が低下します。 |
1. アニーリング温度がプライマーのTm値よりも高い。 2. 変性前の時間が短すぎます。 3. 反応プロトコルの各段階の所要時間が長すぎます。 |
| D.試薬が完全に混合されていない、またはピペッティングエラー | 反応システムにおいて、PCR 反応成分の局所濃度が高すぎるか不均一であるため、PCR が非指数関数的に増幅されます。 | / |
| E.アンプリコン長 | アンプリコンの長さが 300 塩基対を超えて長すぎるため、増幅効率が低くなります。 | アンプリコンの長さが 80 塩基対から 300 塩基対の間であるかどうかを確認します。 |
| F.qPCR試薬の影響 | 試薬中の DNA ポリメラーゼの濃度が低い場合、またはバッファー内のイオン濃度が最適ではない場合、Taq 酵素は最大活性に達しません。 | 標準曲線はプライマーの増幅効率を測定するために使用されます。 |
2.Ct値の範囲
Ct値の範囲は15～35です。Ct値が15未満の場合は、ベースライン位相内にあり、蛍光閾値に達していないとみなされます。理想的には、Ct値と鋳型の初期コピー数の対数との間に直線関係があり、これを標準曲線と呼びます。この標準曲線を用いて、増幅効率が100%の場合、遺伝子の単一コピーを定量するためのCt値は約35と計算されます。Ct値が35を超える場合、理論的には鋳型の初期コピー数は1未満であり、統計的に有意ではないとみなされます。 
異なる遺伝子の場合、遺伝子コピーの初期テンプレート量と増幅効率の変動により Ct 値の範囲が変化するため、遺伝子の線形検出範囲を計算するには、その遺伝子の標準曲線を作成する必要があります。
3. Ct値に影響を与える要因
増幅サイクル数と増幅産物量の関係（増幅産物量 = 初期テンプレート量 × (1 + En)^サイクル数）からわかるように、理想的な条件下では、初期テンプレート量とEnがCt値に影響を与えることがわかります。テンプレートの品質や増幅効率の違いは、Ct値が高すぎたり低すぎたりする原因となります。
4. Ct値が高すぎるか低すぎる
Xiao Yi は、当社の技術部門の専門家に相談し、Ct 値に関する 2 つの一般的な問題の原因と解決策をまとめ、読者にわかりやすく説明しました。
| 問題 | 原因 | ソリューション |
| Ct値が高すぎる | テンプレート濃度が低いか、PCR 阻害物質が存在します。 増幅効率が低い。 |
1. テンプレートの濃度を上げるか、RNA または cDNA の希釈率を上げるか、テンプレートを再度準備します。 2. アニーリング温度を下げるか、2 段階増幅法を使用するか、コンポーネントとシステムが完全に混合されていることを確認するか、反応プロトコルを最適化するか、試薬を交換してみてください。 |
| Ct値が低すぎる | 1. 高テンプレート濃度 2. NTC（テンプレートコントロールなし）およびNRC（逆コントロールなし）の汚染 3. 不適切なプライマー設計 |
1. テンプレート RNA の量を減らすか、cDNA をより高い比率で希釈します。 2. すべての試薬を新しく交換するか、UDGase 汚染防止試薬を使用します。 3. 非特異的増幅を避けるために手順を最適化します。 |
これで、この問題における異常なCt値の原因分析は終了です。次に、Xiao Yiが、実験データの精度と信頼性を高めるための費用対効果の高い製品をいくつかご紹介します。ぜひお気に入りを見つけてください！