تتناول هذه المقالة تطبيق كونكانافالين أ وارتباطه التساهمي بالخرز المغناطيسي.
الجزء الأول. كونكانافالين أ
كما يوحي الاسم، فإن حبات Concanavalin A-Coated Magnetic Beads (ConA beads) عبارة عن حبات مغناطيسية حيوية يتم فيها ربط الليكتين النباتي Concanavalin A (ConA) بمواد نانوية فائقة المغناطيسية. وفيما يلي مقدمة موجزة عن حبات ConA المغناطيسية.
كان كونكانافالين أ (ConA)، وهو بروتين لاكتين نباتي لا يرتبط بفصيلة الدم، أول بروتين لاكتين نباتي يتم عزله وتنقيته وبلورته من حبار (Canavalia ensiformis, Pennisetum maritimum) منذ عام 1936.
يحتوي ConA على شكلين رئيسيين اعتمادًا على درجة حموضة المحلول الذي يوجد فيه: ثنائي التماثل α-2 أو رباعي التماثل α-4 [2]في ظل الظروف القلوية (درجة الحموضة> 7.0) يوجد على شكل رباعي (يتكون من أربع وحدات فرعية بوزن جزيئي 26 كيلو دالتون)؛ وفي ظل الظروف الحمضية (درجة الحموضة 4.5-5.5) يتفكك ConA إلى بنية ثنائية الترابط نشطة (52 كيلو دالتون). بالإضافة إلى ذلك، تتأثر وظيفة ConA بالكاتيونات ثنائية التكافؤ، على سبيل المثال، في غياب أيونات المعادن (Ca2+ و من2+)، لا يمكن تحقيق تكوينه ووظيفة ربط الجليكوبروتين[1].
الشكل (1). النمذجة الجزيئية لـ (أ) مونومر ConA، (ب) ثنائي ConA، (ج) رباعي ConA مع المانوز والجلوكوز والأيونات المعدنية.
الجزء الثاني. الخرز
الخرزات المغناطيسية الحيوية هي فئة من الكرات الدقيقة المغناطيسية ذات حجم الجسيمات النانومترية، والتي تتكون من البوليمرات والجسيمات النانوية المغناطيسية غير العضوية. يمكن تصنيف الخرزات المغناطيسية إلى ثلاث فئات رئيسية وفقًا لبنيتها: بنية من نوع اللب والقشرة، وبنية من نوع الساندويتش، وبنية من نوع الانتشار. تشمل المواد المغناطيسية مسحوق الحديد النقي، وحديد الكربونيل، والخام المغناطيسي، والأورثوفيريت، وسبائك الكوبالت الحديدية. وآخرون.
المواد النانوية المغناطيسية، بسبب تأثيراتها الخاصة، مثل تأثير الحجم الصغير، وتأثير السطح وتأثير الحجم الكمي، وما إلى ذلك، في حجم Fe3ا4 عندما تكون الجسيمات النانوية أقل من 30 نانومتر، فإن تداخل الاضطراب الحراري داخل الجسيمات النانوية يكون كبيرا، وفي هذا الوقت، تظهر هذه الجسيمات النانوية خاصية مغناطيسية خاصة، أي المغناطيسية الفائقة.3ا4 تُستخدم الجسيمات النانوية على نطاق واسع في الصناعة البيولوجية بسبب خصائصها عالية الجودة، مثل عدم السمية، والتوافق البيولوجي الجيد، وخصائص الاستهداف المغناطيسي الفريدة، وسهولة توليد الحرارة في المجالات المغناطيسية المتناوبة.
على النقيض من ذلك، فإن الاقتران التساهمي لـ ConA مع الكرات الدقيقة لتثبيت الجزيئات الحيوية له المزايا التالية:
- ارتفاع استقرار الارتباط التساهمي من أجل إمكانية إعادة الإنتاج؛
- ارتباط الربيطة ConA بسطح الكريات الدقيقة للتفاعلات الجزيئية المستهدفة؛
- التوصيف الحركي لبيئة الحل، المناسبة للتلاعب التجريبي البيولوجي؛
الجزء 3. تطبيق حبات ConA المغناطيسية
كما ورد في الأدبيات، يتم تصنيف التطبيقات الرئيسية للخرز المغناطيسي ConA إلى 3 سيناريوهات، وهي إجراء فصل الغشاء السيتوبلازمي، وإثراء الجليكوبروتين، وفصل الجوانب الخلوية الثابتة.
التطبيق الأول: فصل الغشاء السيتوبلازمي
استخدام حبيبات مغناطيسية ConA تتأثر بتنشيط الكاتيونات ثنائية التكافؤ، بحيث توجد في Ca2+ و ملغ2+ تعتبر بيئات المحلول، التي تمتلك وظيفة التفاعل التقاربي بين α-D-mannosyl الطرفي وα-D-glucosyl، المستخدمة في تنقية الغشاء البلازمي، طريقة بسيطة وفعالة. على سبيل المثال، يعد فصل الغشاء البلازمي للخلايا أو الأنسجة خطوة أساسية للحصول على بروتينات الغشاء البلازمي بشكل أكبر. ConA قادر على ربط البروتينات السكرية على الخلايا، ويمكن الاستفادة من هذا المبدأ للحصول على غشاء بلازمي أكثر نقاءً. خطوات التشغيل الرئيسية هي: تثبيت ConA على الخرز المغناطيسي عن طريق ربط ConA البيوتيني بالخرز المغناطيسي ستربتافيدين؛ حضانة الأغشية الخلوية بالخرز المغناطيسي ConA لمدة ساعة واحدة؛ الامتزاز على رف مغناطيسي؛ الغسيل بـ TBS لمدة 5 مرات؛ وإفلات محلول الغشاء السيتوبلازمي بالمذيب[3].
الشكل 2. خطوات تنقية حبيبات ConA المغناطيسية للغشاء البلازمي
التطبيق الثاني: إثراء الجليكوبروتين
إن ConA خاص بالمانوز والجلوكوز ويتعرف على المانوز المقترن بـ α، والذي يعتبر "السكريات القليلة السكاريد الأساسية" للعديد من البروتينات السكرية في المصل وغشاء الخلية. لذلك، يمكن استخدامه في علم المناعة لفصل الجزيئات السكرية مثل البروتينات السكرية في محاليل الخلايا أو الأنسجة أو المصل.
كان الإجراء الرئيسي هو باستخدام اللآلئ النانوية المغناطيسية الأمينوسيلانية المتشابكة مع ConA عبر رابط ثنائي الوظيفة، ثنائي هيدروكسي سوكسينيميد لينوليت (DSS)، للحصول على خرزات مغناطيسية ConA؛ لإنهاء الارتباط غير النوعي لللؤلؤ النانوي المغناطيسي باستخدام ميثوكسي إيثيلين جليكول (MEG)، ولإجراء الفصل المغناطيسي؛ لإضافة مستخلص بروتينات الغشاء الخلوي المهضومة بالتربسين لاحتضان كل من خرزات ConA المغناطيسية والجليكوببتيدات الملتقطة، وأخيرًا لإفراز الجليكوببتيدات الملتقطة، وإجراء التجفيف بالتفريغ. تم احتضان خرزات ConA المغناطيسية، وتم جمع خرزات ConA المغناطيسية التي كانت تحتوي على جليكوبروتينات مرتبطة بواسطة الرف المغناطيسي، وتم غسل الجليكوببتيدات غير السكرية، وأخيرًا تم إفراغ الجليكوببتيدات الملتقطة وتجفيفها بالتفريغ. تسمح هذه الطريقة بتحليل متعمق لمواقع الجليكوزيل المحددة للبروتينات المرتبطة بالورم (على سبيل المثال، EGFR)[4].
الشكل 3. جسيمات نانوية فائقة المغناطيسية مقترنة بلكتينات مختلفة
التطبيق الثالث: عزل الخلايا الثابتة
إن استخدام حبيبات مغناطيسية ConA (حبيبات مغناطيسية مرتبطة تساهميًا بمرافق عالي النقاء Concanavalin A) للارتباط بالجليكوبروتينات الموجودة على الأغشية الخلوية أو الأغشية النووية، وبالتالي التقاط الخلايا أو النوى، يسمح بتصور التلاعب التجريبي بأعداد صغيرة من الخلايا. على سبيل المثال، تُستخدم حبيبات مغناطيسية ConA في CUT&Tag وCUT&RUN [5] التجارب، التي هي تقنيات جديدة تستخدم لدراسة بنية ووظيفة الكروماتين، ويتم تثبيتها عن طريق ربط حبيبات مغناطيسية ConA بالخلايا لتوضيح العملية وتجنب مشكلة فقدان الخلايا الناجمة عن الطرد المركزي.
بالمقارنة مع تقنية ChIP-seq التقليدية لدراسة تفاعلات الحمض النووي والبروتين، تتمتع تقنيتا CUT&Tag وCUT&RUN بالمزايا التالية:
- ترتبط حبيبات ConA المغناطيسية بجليكوبروتينات غشاء الخلية لتوضيح العملية وتعزيز تجربة التشغيل التجريبي؛
- لا حاجة إلى الطرد المركزي، فقط حبيبات ConA المغناطيسية الممتصة على الرف المغناطيسي لإكمال فصل عينات الخلايا والحلول؛
- يمكن تشغيلها باستخدام ما يصل إلى 10 خلايا فقط، مما يتجنب الحاجة إلى عدد كبير من العينات لـ ChIP-seq.
الشكل 4. مخطط تخطيطي لتدفق تجربة ChIP-seq وCUT&Tag وCUT RUN
الجزء 4. خرزات كونكانافالين المغناطيسية المطلية بمادة A من شركة YEASEN
تتميز حبيبات ConA المغناطيسية التي طورتها شركة YEASEN بقدرتها على الارتباط بالجليكوبروتينات والجليكوليبيدات والسكريات المتعددة والجزيئات الأخرى عن طريق تعديل عملية الجليكوزيل بطريقة سريعة وفعالة وحساسة ومحددة بعد اختيار المواد الخام بدقة وتحسين العمليات المتعددة. تُستخدم بشكل أساسي لعزل الخلايا أو لعزل الجزيئات السكرية مثل الجليكوبروتينات في محاليل الخلايا أو الأنسجة أو المصل، وتُستخدم بشكل خاص بشكل مباشر في التجارب مثل CUT &RUN وCUT&Tag (تقنية مبتكرة لتجارب ChIP-seq).
1.مميزات المنتج
- إنتاج دفعات مستقرة وإمكانية أفضل لإعادة إنتاج النتائج؛
- تخزين الأداء المستقر
- كفاءة التقاط الخلايا>90%
2. معلومات المنتج
| القط رقم | القط رقم 19810ES |
| مقاس | 1مل/5مل/20مل |
| لون | أصفر بني |
| تركيز الخرز | 10 ملغ/مل |
| محتوى قوي | 9-11 ملغ/مل |
| حجم الخرزة | 1 ميكرومتر |
| سعة | 105 خلايا/ميكرولتر من الخرز |
3. بيانات أداء المنتج
(1)أحادية التشتت
في ظل نفس ظروف المعالجة وتحت تكبير 10×/40×، كانت حبيبات ConA موزعة بشكل أساسي بشكل أحادي، ولم يتم ملاحظة أي تكتل واضح نسبيًا مقارنة بالمنافس.
| خرز من مادة YEASEN الخام | خرز ConA المنافس | خرزات ConA من YEASEN (رقم القطعة 19810) |
الشكل 5. رسم بياني لنتائج التشتت الأحادي
(2) تأثير حبيبات ConA على ربط الخلايا
تم حضانة نفس عدد الخلايا مع الخرز لنفس المدة الزمنية، وتم الكشف تلقائيًا عن عدد الخلايا المتبقية بعد اقتران حبيبات ConA تحت محلل الخلايا، وأظهرت النتائج أن YEASEN تفوقت حبيبات ConA (Cat#19810) على منتجات المنافسين.
| تعليق الخلايا | الخلايا المتبقية بعد ربط حبيبات مغناطيسية تنافسية من نوع ConA | الخلايا المتبقية بعد ارتباط YEASEN خرزات مغناطيسية ConA |
الشكل 6.صورة لخلايا مرتبطة بحبات مغناطيسية ConA
(3) رقم ارتباط الخلية وإمكانية التكرار
كلا من 10µL YEASEN ترتبط حبيبات ConA (رقم الصنف 19810) وحبات ConA المنافسة بحجم 10µL بأعداد من الخلايا بمستوى E7 مماثلة لتلك التي يمتلكها المنافس. كانت نسبة التقاط الخلايا >90% في ظل العمليات المتكررة.
الشكل 7. النتائج عدد الخلايا المرتبطة بحبات ConA ومعدل الالتقاط
(4) استقرار التسارع
توزيع 1 مل/أنبوب. كانت ظروف التخزين: 4 درجات مئوية، ومعالجة مسرعة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 و4 و7 و11 و14 يومًا، ومعالجة تدمير عند -20 درجة مئوية لمدة 1 و3 و6 و8 أيام. أظهرت النتائج أنه في ظل نفس الظروف التجريبية: كان معدل التقاط الخلايا للمنتجات المخزنة عند 4 درجات مئوية، والمعالجة المسرعة عند 37 درجة مئوية ومعالجة التدمير عند -20 درجة مئوية >95٪، وكانت قيمة معامل التباين للمجموعات الثلاث من التكرارات في كل حالة معالجة في حدود 1٪، مما أظهر قابلية جيدة للتكرار.
الشكل 8. النتائج معدل التقاط الخلايا وتحيز التكرار لحبيبات ConA تحت درجات حرارة وزمن مختلفين
معلومات الطلب
| 19810ES |