تطور وأهمية هياكل CAP في تقنية مرنا

يُعدّ هيكل الغطاء عنصرًا أساسيًا في تطوير لقاحات وعلاجات mRNA. تعتمد تقنية mRNA الاصطناعية على Cap1 لتعزيز الاستقرار وكفاءة الترجمة، وتقليل التعرّف المناعي الفطري على mRNA بواسطة مستقبلات TLRs وغيرها من أجهزة الاستشعار المناعية، مما يُقلّل من التنشيط المناعي غير المرغوب فيه. هذا يمنع الاستجابات الالتهابية غير المرغوب فيها، وبالتالي يُحسّن استقرار وفعالية mRNA العلاجي في الخلايا البشرية.

الاكتشاف المبكر وبنية Cap0

في منتصف سبعينيات القرن الماضي، كشفت الأبحاث المتعلقة بالرنا المرسال (mRNA) في حقيقيات النوى عن بنية طرفية 5' تُعرف الآن باسم Cap0، حيث ترتبط غطاء N7-ميثيل غوانوزين (m7G) بالنوكليوتيد الأول عند الطرف 5'. وُجد أن هذا التعديل يحمي الرنا المرسال من التحلل بواسطة النوكليازات الخارجية، ويساعد في التصدير النووي، ويعزز التعرف على الريبوسوم لبدء عملية الترجمة. كان Cap0 أول بنية غطاء مُميزة، حيث اقتصرت مثيلته على غطاء الغوانوزين نفسه. مثّل اكتشاف هذا الغطاء 5' ووظائفه إنجازًا هامًا في فهم أغطية الرنا المرسال في حقيقيات النوى ودورها في تعديلات الرنا المرسال.

Cap0 Structure

ظهور Cap1

بنية Cap1، وهي سمة أساسية في mRNA حقيقيات النوى، تلعب دورًا محوريًا في استقرار mRNA وترجمته والتعرف المناعي عليه. تطورت بنية غطاء mRNA، المكونة من N7-ميثيل غوانوزين (m7G) المرتبط بالنوكليوتيد الأول عبر رابط ثلاثي الفوسفات 5'-5'، من دراسات مبكرة على تعديلات mRNA بعد النسخ في حقيقيات النوى في سبعينيات القرن العشرين.

Cap1 Structure

بنية الرنا المرسال المغطى بالطرف 5'. 【1】 كشفت المزيد من الدراسات أنه في معظم الرنا المرسال حقيقيات النوى، يُمَيَّثَ أيضًا النوكليوتيد الأول الذي يلي الغطاء (الموضع +1) عند الموضع 2'-O في الريبوز، وهي عملية تُعرف باسم ميثلة 2'-O. أضاف هذا الاكتشاف، المعروف باسم بنية Cap1 (m7GpppNm)، مستوى آخر من الأهمية الوظيفية لتعديلات الرنا المرسال. وُجِد أن تعديل Cap1 يُحسِّن استقرار الرنا المرسال ويمنع الجهاز المناعي الفطري من التعرف عليه، وخاصةً في خلايا الثدييات، حيث يُساعد على التهرب من التعرف عليه بواسطة مستقبلات التعرف على الأنماط مثل RIG-I وTLRs وMDA5【2】. كان هذا أمرًا بالغ الأهمية لكل من استقلاب الرنا المرسال وتقدم التقنيات القائمة على الرنا المرسال، بما في ذلك تطبيقات التطعيم والعلاج الجيني باستخدام الرنا المرسال.

التحديات التقنية في صناعة mRNA والحلول الحالية

لا تزال هناك تحديات تقنية عديدة تواجه تطبيق لقاحات mRNA على نطاق واسع وتحسينها، بما في ذلك مشاكل تتعلق بجرعات mRNA العالية، والاستجابات المناعية، والاستقرار، وطريقة توصيل اللقاح. ومن التحديات الكبيرة في صناعة mRNA الحاجة إلى جرعات عالية من mRNA لإحداث استجابة مناعية قوية. ويعود ذلك إلى عدة عوامل:

التدهور السريع: يعتبر mRNA غير مستقر بطبيعته وعرضة للتدهور عن طريق إزالة الأغطية من الإنزيمات والريبونوكليازات (RNases) الموجودة في الأنظمة البيولوجية.

كفاءة الترجمة المحدودة: تختلف كفاءة ترجمة mRNA إلى بروتين، مما يتطلب كميات أكبر منه لتوليد مستويات كافية من المستضدات للاستجابة المناعية. ترتبط كفاءة الترجمة بألفة Cap1 وعامل بدء الترجمة eIF4E.

Translation Initiation Complex

تكوين مجمع بدء الترجمة الأساسي في حقيقيات النوى.【3】

المناعة وردود الفعل المناعية غير المرغوب فيها: ثالث أكبر عقبة هي الاستجابة المناعية الفطرية التي قد يُحفّزها الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) نفسه، وخاصةً الحمض النووي الريبوزي ثنائي الرنا (dsRNA) أو الحمض النووي الريبوزي المرسال غير المكتمل. في حين أن مستوىً معينًا من التنشيط المناعي مطلوب لتحفيز الجهاز المناعي التكيفي، إلا أن التنشيط المفرط قد يؤدي إلى استجابات التهابية، مما قد يُقلل من فعالية اللقاح أو يُسبب آثارًا جانبية.

تاريخ تكنولوجيا التغطية

  1. تقنية التغطية الأنزيمية: التغطية الإنزيمية، التي طُرِحَت في بدايات أبحاث mRNA، تتضمن استخدام إنزيمات تغطية مثل غوانيليل ترانسفيراز وميثيل ترانسفيراز لإضافة غطاء طبيعي 5' بعد النسخ. تضمن هذه الطريقة دقة عالية وكفاءة تغطية في ترجمة mRNA، وخاصةً في التطبيقات العلاجية.

  2. نظائر الأغطية الاصطناعية (1980-2000): طوّر باحثون نظائر غطاء اصطناعية لتخليق mRNA المغطى في المختبر، مما يُساعد في دراسة وظيفة mRNA والتعبير الجيني. نظير الغطاء المضاد للانعكاس (ARCA) هو نظير غطاء اصطناعي مُصمم لمنع دمج الغطاء بشكل غير صحيح أثناء تخليق mRNA، مما يُحسّن كفاءة ترجمة mRNA في اللقاحات والعلاجات الجينية. مع ذلك، فإن كفاءة التغطية وعائد تغطية ARCA منخفضان.

  3. تكنولوجيا Cap1 (2010): طريقة تغطية النسخ المشترك Cap1، التي تُبسّط العملية بدمج الغطاء مباشرةً أثناء تخليق mRNA. تُحسّن هذه الطريقة الكفاءة وتُنتج نسبة عالية من mRNA مُغطّى بشكل صحيح، مما يجعلها مثالية للتطبيقات العلاجية واسعة النطاق، مثل لقاحات mRNA.

في الوقت الحالي، كانت تقنيات التغطية الأنزيمية حاسمة في تطوير العلاجات القائمة على mRNA، بما في ذلك لقاحات COVID-19، مما يضمن استقرار وترجمة mRNA العلاجية بشكل فعال.

مقارنة التغطية الأنزيمية، الجيل القادم تغطية LZCap وطريقة التغطية من الجيل الأول (ARCA)


تطوير الجيل القادم من نظائر الأغطية

هدفنا هو تطوير نظائر للغطاء تتميز بمقاومة إنزيمات إزالة الغطاء، وتقارب عالٍ مع عامل eIF4E لتحسين كفاءة الترجمة، وانخفاض المناعة. تُعد هذه التطورات بالغة الأهمية لتعزيز فعالية العلاجات القائمة على mRNA، بما في ذلك علاجات السرطان وتطبيقات العلاج الجيني.

تصميم LZCap

عند تصميم LZCap، ركزنا بشكل رئيسي على إنشاء نظير غطاء ذي ألفة عالية لـ eIF4E. تتميز الإنزيمات بتمييز "محدد" نسبيًا للركائز. لذلك، عند تصميم بنية غطاء جديدة، نسعى جاهدين للحفاظ على التشابه مع البنى الطبيعية/المعروفة قدر الإمكان. تحتوي البنية الطبيعية على ريبوز 3'OH، والذي يمكن تعديله (مثل الميثيل). بناءً على هذا الاعتبار، اخترنا إضافة ذرة كربون في الموقع 3' لإضفاء طابع جديد، متبوعة بذرة NH لمحاكاة الرابطة الهيدروجينية لـ OH، ثم مجموعة أسيتيل لتقليل قاعدية NH وتعزيز قدرتها على تكوين روابط هيدروجينية. يتميز LZCap بنشاط أفضل من المثيل الطبيعي للغطاء، ربما بسبب زيادة الرابطة الهيدروجينية. بالمقارنة مع مجموعتي الميثيل والميثوكسي، قد تزيد مجموعة الأسيتيل الأمينية أيضًا من تفاعلات فان دير فالس بين الركيزة (الغطاء) وعامل البدء (الإنزيم).

استقرار مجموعة الأسيتيل الأمينية

مجموعة الأسيتيل الأمينية مستقرة بما فيه الكفاية. وهي أكثر استقرارًا بكثير من الموضع الميثيلي 7 والرابطة الفوسفودايسترية، وهما أقل أجزاء الغطاء استقرارًا.

كفاءة العائد والتغطية لـ LZCap

باستخدام غطاء LZCap AG(3'Acm)، تبلغ كفاءة تغطية mRNA للوسيفيراز حوالي 97.59%، ويمكن الحصول على ما يصل إلى 200 ميكروغرام من mRNA مُغطى باستخدام قالب DNA بتركيز ميكروغرام واحد في تفاعل نسخ قياسي في المختبر (IVT) مع بوليميراز T7 RNA. تصل نقاء mRNA إلى 99% بعد ترسيب LiCl البسيط. تجعل هذه الكفاءة العالية في التغطية وعائدها LZCap خيارًا جذابًا لتطبيقات متنوعة، بما في ذلك إنتاج البروتين والعلاج الجيني.

يعد هيكل الغطاء مكونًا أساسيًا في تطوير لقاحات mRNA والعلاجات.تعتمد تقنية mRNA الاصطناعية على Cap1 لتعزيز الاستقرار وكفاءة الترجمة، وتقليل التعرف المناعي الفطري على mRNA بواسطة مستقبلات TLRs وغيرها من أجهزة الاستشعار المناعية، مما يقلل من التنشيط المناعي غير المرغوب فيه. هذا يمنع الاستجابات الالتهابية غير المرغوب فيها، وبالتالي يُحسّن استقرار وفعالية mRNA العلاجي في الخلايا البشرية.

منتج

كاب إيه جي (3'-اميثيل-7 ميكروغرام)

غطاء LZ AG(3'Acm)

إيه جي (لا يوجد حد أقصى)

إنتاج mRNA (ميكروغرام)

164

173

200

تحليل طيف الكتلة (MS) لكفاءة تغطية لوسيفيراز mRNA المغطى بـ LZ باستخدام طريقة تعتمد على RNAse H. بلغت كفاءة التغطية حوالي 97.59%.

ما مدى استقرار mRNA تجاه إنزيم إزالة الغطاء؟

أظهرت أحماض mRNA التي تحتوي على LZCap AG(3'Acm) وLZCap AG M6 (3'Acm) مقاومة أعلى لإنزيم إزالة الأغطية (NEB). يُلاحظ أن CapM6 (3'-OMe-6mA-7mG) مقاوم أيضًا لإنزيم إزالة الأغطية، بينما لا يُظهر Cap AG العادي (3'-OMe-7mG) هذه المقاومة.

ما هي تقارب الارتباط بين LZCap و eIF4E؟

ماذا عن التعبير البروتيني لـ LZCap AG(3'Acm) المغطى بـ mRNA؟

إن التعبير عن mRNA المُغطى للوسيفيراز LZCap AG(3'Acm) أعلى بكثير من التعبير عن mRNA المُغطى لنظير Cap1 (3'-OMe-7mG) في سلالات خلوية مختلفة* (3T3-L1، Hela، JAWs، HEK293T وHuh7). أظهرت تجربة التكرار 130 مرة تعبيرًا أعلى بحوالي 1.5 مرة عن mRNA المُغطى للوسيفيراز LZCap AG(3'Acm) مقارنةً بـ mRNA المُغطى (3'-OMe-7mG) في المتوسط. ولوحظت نتائج مماثلة لدى الفئران. قد يختلف مستوى التعبير البروتيني قليلاً باختلاف تسلسل mRNA.

هل لديك المزيد من البيانات الحيوانية؟

كفاءة التعبير عن LZCap AG(3'Acm) أو LZCap AG(3'FMom) المغطى

يظهر ترميز mRNA لـ GLuc تعبيرًا أعلى في الجسم الحي مقارنةً بـ mRNA المغطاة بـ CapAG (3'-OMe-7mG) في قرد Cynomolgus والخنزير.

ماذا عن المناعة الفطرية لـ mRNAs المغطاة بـ LZCap AG؟

أظهرت أحماض الرنا المرسال المغلفة بـ LZCapAG (3'Acm) مناعة فطرية منخفضة. تلعب TLR8 وTLR7 وIL-1A وB دورًا مهمًا في الاستجابة المناعية المُحفَّزة بواسطة RNA غير المغلف. أظهرت الدراسات الحية لتحليل مناعة RNA المغلفة بـ LZCap أن RNA غير المغلف يُسبب تغيرات كبيرة في مستوى نسخ العوامل المناعية لدى الفئران. أظهر كلٌّ من أحماض الرنا المرسال المغلفة بـ LZCap و3'-OMe-7mG مستوى نسخ أقل لعوامل المناعة لدى الفئران بعد حقنة واحدة مُحفَّزة بـ RNA.

هل قمت ببعض اختبارات السلامة؟

نعم، لقد أجرينا اختبار السمية الخلوية، ودراسة تثبيط البوليميراز البشري واختبار أميس.

  1. لم يتم ملاحظة أي سمية خلوية أو سمية قليلة لمونومر النوكليوسيد من 3'-Acm-7mG (CC50> 10000nM) في خلايا 293T وHuh7 وMRC5 وTHP1 وU87MG.
  2. بوليميريز الحمض النووي البشري ( α ,β , غاما وتُظهر دراسات تثبيط نشاط بوليميراز الحمض النووي الريبي للميتوكوندريا (hPOLRMT) و (Klenow) أن 3'-Acm-7mG TP لا يثبط بوليميراز الحمض النووي الريبي البشري أو الحمض النووي الريبي.
  3. يكشف اختبار الطفرة العكسية البكتيرية (Ames) عن التغيرات الجينية المصاحبة، بالإضافة إلى المواد المسرطنة السامة للجينات، لدى معظم القوارض والبشر. وقد أظهر اختبار Ames عدم سمية 3'-Acm-7mG للجينات.

هل تم تسجيل براءة اختراع لهذا المنتج؟

نعم، تم منح براءة الاختراع في الولايات المتحدة الأمريكية.

معلومات الطلب

اسم المنتج تحديد رقم الكتالوج
غطاء LZ AG(3'Acm)（ (100 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10684ES
غطاء LZ AU(3'Acm)( 100 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10685ES
غطاء LZ GG(3'Acm)（ (100 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10686ES
LZCap AG(3'Ma-Cy5)（ (25 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10688ES
غطاء LZ AG(3'Ma-Cy7)( 25 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10689ES
LZCap (AG(3'Ma-Cy3) (25 مليمول) 100 ميكرولتر، 1 مل 10687ES
LZCap (AG(3'Ma-البيوتين) (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل سؤال
LZCap (AG(3'Ma-Peg5-FAM) (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل سؤال
LZCap (AG(3'Ma-C6-MANT) (25 ملم) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) Firefly luc mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) eGFP mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) eGFP saRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) RFP mRNA (1 ميكروجرام/ميكرولتر) 100 ميكرولتر، 1 مل سؤال
LZCap (AG(3'Acm) Cas9 mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار
LZCap (AG(3'Acm) Gluc mRNA (1μg/μL) 100 ميكرولتر، 1 مل أنااستفسار

مرجع:

  1. الآليات الجزيئية لتكوين وتغطية الحمض النووي الريبوزي لفيروس كورونا، فيرولوجيكا سينيكا 31(1)
  1. لقاحات mRNA - عصر جديد في علم اللقاحات. اللجنة الوطنية لمكافحة المخدرات 17، 261–279 (2018).
  2. بدء الترجمة يتم تنظيمه بواسطة بروتين رابط الحمض النووي الريبوزي في الثدييات: تعديل مجمع بدء الترجمة بواسطة العوامل المؤثرة على النقل والخلايا 2021, 10(7)، 1711

سؤال