qPCR 實驗有時看起來很簡單，有時又很困難。引子設計完成後，像PCR一樣逐步加入qPCR樣品，即可在機台上完成實驗。本文介紹了染料法qPCR實驗中常見的幾個問題，並給出了可能的原因和解決方法，希望可以幫助大家解決qPCR實驗中的困擾。

1.什麼是qPCR？
2. qPCR擴增曲線異常
3. qPCR熔解曲線異常
4. 訂購資訊
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6.關於閱讀

1.什麼是qPCR？

自從聚合酶鍊式反應技術（PCR）發明以來，PCR憑藉其簡單、廉價、可靠、快速、靈敏度高等特點，可能是分子生物學中應用最廣泛的技術。 qPCR是由PCR技術發展出來的技術。在DNA擴增過程中，以螢光染料檢測每個PCR循環後產物總量的方法，不僅具有PCR的快速性、靈敏度高，而且具有特異性強、即時監測、可重複和準確定量等優點。 qPCR是一種利用定量即時PCR擴增設備即qPCR儀，在PCR過程中即時監測核酸擴增產物的技術。 qPCR透過Ct值及標準曲線的分析來實現起始模板的定量分析。 1992年日本人樋口首次提出「即時螢光定量PCR技術」。 1996年美國生物公司推出全球第一台螢光定量PCR儀，該儀器由PCR擴增熱循環系統、螢光檢測光學系統、電腦及應用軟體所組成。透過螢光染料或螢光探針即時監測核酸擴增產物。 ，透過數學函數關係，結合軟體進行結果分析，實現待測樣品初始模板量的計算。因此實時螢光定量PCR技術得到了廣泛的應用。用於qPCR的螢光標記方法分為基於SYBR Green I染料法的螢光染料鑲嵌法、基於Taqman探針法（Cycling Probe、Molecular Bracon等）的螢光探針法、猝滅染料引子法。

qPCR 實驗有時看起來很簡單，有時又很困難。引子設計完成後，像PCR一樣逐步加入qPCR樣品，即可在機台上完成實驗。但要注意很多小細節，例如管壁上不能掛有液體，管內不能有氣泡，要盡量減少管壁、管蓋等的直接接觸，以減少實驗誤差或奇怪的實驗結果。小毅整理了幾個染料法qPCR實驗中常見的問題，並給出了可能的原因和解決方法，希望可以幫助大家解決qPCR實驗中的煩惱。

2. qPCR擴增曲線異常

2.1 擴增曲線對數圖基線期異常

圖 1. 擴增圖

可能的原因：

基線設定不當。

解決方案：

建議增加基線的端點值。調整範例圖如下。

圖 2. 擴增圖

2.2 擴增曲線對數圖曲線分割

圖 3. 擴增圖

可能的原因：

基線設定得太高。

解決方案：

建議降低基線的端點值。調整範例圖如下。

2.3 擴增曲線線性圖不光滑

圖 4. 擴增圖

可能的原因：

1）PCR反應管蓋不嚴，反應液洩漏。
2）帶掛壁的PCR反應液。
3)儀器未經過校準（包括自動校準或ROX校準）。
4)體系中抑制劑較多，導致螢光不穩定。
5)儀器過度使用導致螢光收集不穩定。

解決方案：

1）將管蓋壓緊。
2)充分混勻試劑，充分離心後小心放入定量儀中。
3)校準儀器。
4)提高RNA純度，選擇適當的逆轉錄試劑。

2.4 放大曲線線性圖在平台處呈鋸齒狀

圖 5. 擴增圖

可能的原因：

1）   RNA純度差，雜質多。
2）   儀器使用時間過長。

解決方案：

1）   重新提取高品質RNA。
2）   稀釋 RNA 模板以降低雜質的濃度。
3）   校準儀器。

2.5 擴增曲線的線性圖未能達到平台期

圖 6. 擴增圖

可能的原因：

1）   模板濃度低（Ct值約35）。
2）   擴增循環數太少。
3）   試劑擴增效率低（Ct值小，但也無法達到平台期）。

解決方案：

1）   增加模板的濃度。
2）   增加循環次數。
3）   增加鎂²⁺ 專注。

2.6 擴增曲線線性圖平台下垂

圖 7. 擴增圖

可能的原因：

1）   存在降解（擴增產物降解、SYBR 降解）。
2）   管蓋未蓋好，試劑揮發。
3）   cDNA濃度過高（Ct值太小，螢光閾值拉高，下垂較嚴重）。
4）   管內有氣泡，然後它們消失。

解決方案：

1）   提高系統純度。
2）   減少 cDNA 量（稀釋模板）。
3）   降低基線的端點值。

2.7 擴增曲線中Ct值過大

圖 8. 擴增圖

可能的原因：

1）   模板數量少。
2）   擴增效率低。
3）   PCR 片段太長。
4）   反應體系中存在抑制劑。

解決方案：

1）   盡量減少稀釋倍數或增加模板量，使Ct值落在15~30之間。
2）   優化反應條件，嘗試三步驟擴增程序，或重新設計引子。
3）   PCR產物長度設計在100-150bp內，不建議超過300bp。
4）   複製更高純度的模板。

2.8 擴增曲線重複性差

圖 9. 擴增圖

可能的原因：

1）   較大的尖峰誤差。
2）   試劑和系統未充分混合。
3）   cDNA 拷貝數低。
4）   沒有使用 Rox 校準。

解決方案：

1）   校準移液管。
2）   充分混合反應體系。
3）   模板濃度低，重複性差，4-6個化合物孔，1-2個偏差較大的數值可以適當丟棄。
4）   最好使用Rox校準。如果所使用的試劑不含Rox，則參考染料需要選擇為None。

2.9 隨機擴增曲線

圖 10. 擴增圖

可能的原因：

Rox濃度與模型不符。

解決方案：

將儀器上的參考染料設定從ROX改為NONE，觀察擴增曲線是否恢復正常。

2.10 NTC 峰值

2.10.1 Ct>35，熔融曲線Tm值<80℃

圖 11. 擴增圖

可能的原因：

引子二聚化結果。

解決方案：

優化引子。

2.10.2 Ct值<35，NTC解離曲線與基因解離曲線峰形重疊

圖 12. 擴增圖

可能的原因：

反應體系污染。

解決方案：

逐一檢查污染源。

3. qPCR熔解曲線異常

3.1 熔解曲線單峰但不尖銳

圖 13. 熔解曲線圖

可能的原因：

1）   與試劑成分、儀器型號有關。
2）   存在類似大小的片段的非特異性擴增。

解決方案：

1）   從峰值開始到峰值結束的溫度跨度不高於7°C。結果被認為是可用的，即單峰。
2）   採用高濃度瓊脂糖電泳(如3％瓊脂糖)輔助測定。

3.2 解離曲線呈雙峰狀，下峰Tm在80℃前

圖 14. 解離曲線

可能的原因：

存在引子二聚體。

解決方案：

增加退火溫度、降低引子濃度或重新設計引子。

3.3 解離曲線呈雙峰狀，下峰Tm在80℃後

圖 15. 解離曲線

可能的原因：

1）   引子特異性差導致非特異性產物的擴增。
2）   gDNA 污染。

解決方案：

1）   檢查引子的特異性，如果較差則重新設計。
2）   經NRC陰性對照確認，如有，需重新製備模板。

3.4 熔解曲線峰雜亂

圖 16. 熔解曲線圖

可能的原因：

1）   反應體係受到污染。
2）   試劑暴露在強光或高溫下會導致試劑失效。
3）   儀器長時間未校準。
4）   耗材與儀器不匹配。

解決方案：

1）   結合NTC和NRC結果來確認污染，建議逐一排除水、引子、酵素和環境的污染。
2）   建議與新試劑做比較實驗。
3）   建議定期進行儀器校準維護。
4）   確認相應儀器對耗材的要求。

3.5 熔化曲線前端的假峰

圖 17. 熔解曲線圖

可能的原因：

Rox 濃度與模型不符。

解決方案：

建議取消Rox校正，看看解離曲線是否正常。

圖 18. 熔解曲線圖

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