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HisSep Ni-NTA MagBeads His标签蛋白纯化磁珠 20561ES
物品单位 品牌
Yeasen
  • 型号:1 mL
  • 货号:20561ES03
  • 发布日期: 2022-03-25
  • 更新日期: 2022-03-25
产品详细说明
产地
品牌 Yeasen
货号 20561ES03
用途范围
英文名称
纯度 %
CAS编号
规格 1 mL
保质期
是否进口

产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

价格(元)

HisSep Ni-NTA MagBeads His标签蛋白纯化磁珠

20561ES03

1 mL

275.00

20561ES08

5 mL

825.00

 

产品描述

 

His-tag蛋白纯化磁珠是一种高容量的新型磁性微球产品,用于快速、高效的纯化 His标签融合蛋白。磁珠在磁场作用下直接从生物样品中可一步纯化出高达95%纯度的目的蛋白,极大的简化了纯化工艺和提高纯化效率。将含有His标签蛋白的细胞裂解物添加到MagBeads 中,让蛋白质与其充分结合,然后可从磁珠中洗脱分离出目的蛋白。

与传统柱层析方法相比,使用磁珠纯化His标签蛋白无需控制上样流速和多次离心样品,也不需要昂贵的层析和离心设备。样品与磁珠的结合以及目的蛋白与磁珠的分离简单、快捷,而且更容易实现高通量、自动化的蛋白纯化方法。适合科研和工业客户高通量地进行组氨酸标签蛋白的纯化。

该磁珠以4%琼脂糖凝胶为基质通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸(NTA),螯合镍离子(Ni2+)后,可以形成非常稳定的八面体结构,镍离子处于八面体的中心,这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻更加稳定。

His标签蛋白纯化磁珠广泛适用于细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞等分泌或胞内表达的可溶性组氨酸标签蛋白,也可用于变性蛋白的纯化(包涵体需变性后再进行纯化)。

 

产品性质

 

基质

磁性琼脂糖微球

载量

> 40 mg 6×His-tagged protein/mL磁珠

粒径

30-100 μm

磁珠浓度

磁珠悬浮于保护液中,含量为20%(V/V)

储存缓冲液

含20%乙醇的1×PBS

 

运输和保存方法

 

冰袋运输。4℃长期储存,有效期2年。

 

注意事项

 

1.磁珠保存过程中避免冷冻、干燥和高速离心等操作。

2.磁珠使用前,请充分震荡,使磁珠保持均匀的悬浮状态。

3.使用过的磁珠重复使用时,建议纯化同一种蛋白,纯化不同种蛋白时,建议使用新磁珠,以避免交叉污染。

4.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

5.本产品仅作科研用途!

 

使用方法

 

一、缓冲液配制

1.缓冲液使用基本原理:低咪唑上样,高咪唑洗脱,或者高pH上样,低pH洗脱。

2.Buffer在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm滤膜过滤除菌。

3.可溶性蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表1,包涵体蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2和表3。

二、样本制备

2.1细菌或酵母表达的蛋白

1)将培养液转移到离心杯中,7,000 rpm (7,500 xg),离心15 min收集菌体,然后按照菌体:Lysis Buffer=1: 10 (W/V)加入Lysis Buffer,加入终浓度为1 mM的PMSF。同时可加入其他蛋白酶抑制剂,但不能影响目的蛋白与磁珠的结合。

2)加入溶菌酶,使其工作浓度为0.2-0.4 mg/mL。如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE,可以不加溶菌酶。

3)将菌体沉淀悬浮起来,(如果菌液浓度高,也可考虑加入10 μg/mL RNase A和5 μg/mL DNase I),混匀,冰上超声破碎细胞,至菌液基本保持澄清。

4)将澄清的破碎液转移至离心管中,10,000 rpm (15,000 xg),4℃离心20-30 min。 取上清,置于冰上备用或-20℃保存。

2.2酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达可溶性蛋白

1)将细胞培养液转移至离心杯中,5,000 rpm (3,800 xg),离心10 min,收集菌体得上清,如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等物质,即可直接使用;如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质,需用Lysis Buffer透析才能上样。

2)对于大量体积的上清,需加入硫酸铵沉淀浓缩后,然后用Lysis Buffer透析后才能上样。

2.3包涵体蛋白纯化(变性条件)

1)将培养液转移到离心杯中,7,000 rpm (7,500 xg),离心15 min收集菌体,去掉上清。

2)按照菌体:Lysis buffer(不含8M尿素)=1:10 (W/V)将菌体悬浮起来,混匀,冰浴超声破碎。

3)将破碎液转移至离心管中,10,000 rpm (15,000 xg),4℃离心20-30 min。去掉上清,步骤2和3可以重复一次。

4)按照菌体:Lysis buffer(含8M尿素)=1:10 (w/v)的比例将包涵体充分悬浮。

三、磁珠预处理

3.1 准备

将磁珠充分混匀,使用移液器取适量的磁珠悬浮液,置于离心管中,将离心管置于磁力架上,待溶液变澄清后,用移液器吸弃上清。

3.2平衡

将离心管从磁力架上取下来,加入与悬浮液等体积的Lysis Buffer,使用枪头反复吹打5-10次,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸弃清液,重复洗涤2次。

四、磁珠与目的蛋白结合

4.1 结合

将含有目的蛋白的上清液加入到处理好的磁珠中,颠倒混匀。将离心管置于混合仪上,室温旋转孵育30 min (如果目标蛋白不稳定,建议2-8℃下孵育1 h)。

4.2 洗杂

将离心管置于磁分离器,待溶液变澄清后,用移液器移出上清液,保留上清液,以备取样检测。向离心管中加入2倍悬浮液体积的Wash Buffer,使用枪头反复吹打5-10次,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸取上清液,保留,以备取样检测。重复上述步骤2次。

4.3 洗脱

建议将3-5倍磁珠体积的Elution Buffer加入到离心管中,使用移液器轻轻吹打3-5次,混匀,将离心管置于磁分离器上,待溶液变澄清后,用移液器吸取上清液,即为目的蛋白。如有需要,可以重复上述步骤1次,以提高目的蛋白的回收量。用户也可根据实验结果调整缓冲液中的咪唑浓度。

五、磁珠保存

1. 向装有磁珠的离心管中加入1 mL Elution Buffer,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠充分悬浮,然后置于磁分离器,吸弃上清,重复该操作2次。

2. 向离心管中加入1 mL去离子水,用移液器反复吹打3-5次,使磁珠充分悬浮,然后置于磁分离器,吸弃上清,重复该操作2次。

3. 向离心管中加入含20%乙醇的1×PBS,使总体积为磁珠初始悬浮液体积,保存于2-8 ℃。

六、SDS-PAGE 检测

将纯化得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分)使用SDS-PAGE检测纯化效果。 

表1. 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

10 mM imidazole

NaOH调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         0.68 g

 

Wash Buffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

20 mM imidazole

NaOH调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         1.36 g

 

Elution Buffer

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

250 mM imidazole

NaOH调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         17.0 g

 

以上缓冲液适用于多数His标签蛋白的纯化,客户也可根据实验结果调整缓冲液中的咪唑浓度。

表2. 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方,pH洗脱方式

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

Lysis Buffer

8 M Urea

100 mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

Urea             480.50 g

NaH2PO4 ·H2O     13.80 g

Tris·Cl            12.10 g

 

Wash Buffer

8 M Urea

100 mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至6.3,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

Urea             480.50 g

NaH2PO4 ·H2O     13.80 g

Tris·Cl            12.10 g

Elution Buffer

8 M Urea

100 mM NaH2PO4

100 mM Tris·HCl

盐酸溶液调pH至4.5,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

Urea             480.50 g

NaH2PO4 ·H2O     13.80 g

Tris·Cl            12.10 g

表3. 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方,咪唑洗脱方式

缓冲液名称

配方

配制1L溶液所需各种试剂量

 

 

Lysis Buffer

8 M Urea

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

10 mM imidazole

NaOH调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

Urea             480.50 g

NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         0.68 g

 

 

Wash Buffer

8 M Urea

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

20 mM imidazole

NaOH调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

Urea             480.50 g

NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         1.36 g


 

 

Elution Buffer

8 M Urea

50 mM NaH2PO4

300 mM NaCl

250 mM imidazole

NaOH调pH至8.0,0.22 μm或0.45 μm过滤除菌

Urea             480.50 g

NaH2PO4 ·2H2O    7.80 g

NaCl             17.54 g

Imidazole         17.0 g

表4. Ni NTA Magarose Beads试剂耐受情况

试剂种类

浓度

还原剂

5 mM DTE

1 mM DTT

20 mM β-mercaptoethanol

5 mM TCEP

10 mM reduced glutathione

变性剂

8 M urea

6 M Gua-HCl

去污剂

2% TritonTM X-100, nonionic

2% TweenTM20, nonionic

2% NP-40, nonionic

2% Cholate, anionic

1% CHAPS, zwitterionic

其他类

500 mM imidazole

20% ethanol

50% glycerol

100 mM Na2SO4

1.5 M NaCl

1 mM EDTA

60 mM citrate

 

HB220315