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双模式mRNA 建库试剂盒 12301ES
物品单位 品牌
Yeasen
  • 货号:12301ES08
  • 发布日期: 2022-02-07
  • 更新日期: 2022-02-24
产品详细说明
产地
品牌 Yeasen
货号 12301ES08
用途范围
英文名称
纯度 %
CAS编号
规格 8 T
保质期
是否进口

产品信息


产品名称

产品编号

规格

价格/元

Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®

双模式mRNA建库试剂盒

12301ES08

8 T

3875.00

12301ES24

24 T

9875.00

12301ES96

96 T

33875.00

12301ES98

1000 T

282295.00


产品描述


Hieff NGS® Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina®高通量测序平台专门研发的用于mRNA转录组文库构建试剂盒,本试剂盒将cDNA二链合成与Endprep、dA-tailing进行合并,极大地缩减建库时间。二链合成模块配有两种Buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。本产品适用于起始模板为10 ng-4 μg不同来源真核生物总RNA样本。经过mRNA分离、片段化、双链cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和文库扩增,总RNA样品最终转化为适用于Illumina®平台测序的文库。

试剂盒包含两个独立模块,BOX-I的核心为纯化mRNA所需的oligo (dT)磁珠。BOX-II包含片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性ds-cDNA合成,以及后续建库所需的所有试剂。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA第二链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,最大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。


产品组分


组分编号和名称

12301ES08

12301ES24

12301ES96

12301ES98

BOX-I

12603-A

图片5.png

mRNA Capture Beads

0.4 mL

1.2 mL

4.8 mL

50 mL

12603-B

图片5.png

Beads Binding Buffer

0.4 mL

1.2 mL

4.8 mL

50 mL

12603-C

图片13.png

Beads Wash Buffer

5 mL

15 mL

60 mL

3×250 mL

12603-D

图片5.png

Tris Buffer

0.4 mL

1.2 mL

4.8 mL

50 mL

BOX-II

12301-A


图片6.png


Frag/Prime Buffer

150 μL

450 μL

2×900 μL

18.5 mL

12301-B

图片6.png

1st Strand Enzyme Mix

16 μL

48 μL

192 μL

2×1mL

12301-C

图片7.png

Strand Specificity Reagent

50 μL

150 μL

580 μL


8 mL

12301-D


图片8.png

spacer.gif

2nd Strand Buffer (dNTP)

240 μL

720 μL

2×1440 μL

30 mL

12301-E

图片9.png

2nd Strand Buffer (dUTP)

240 μL

720 μL

2×1440 μL

30 mL

12301-F

图片8.png

2nd Strand Enzyme Master Mix

40 μL

120 μL

480 μL

5×1 mL

12301-G

图片10.png图片10.png
图片11.png

Ligation Enhancer

240 μL

720 μL

2×1440 μL

30 mL

12301-H

图片10.png

Novel T4 DNA Ligase

40 μL

120 μL

480 μL

5×1 mL

12301-I


2×Super Canace® II High-Fidelity Mix

200 μL

600 μL

2×1200 μL

25 mL

12301-J

图片11.png

Primer Mix

40 μL

120 μL

480 μL

5 mL



运输与保存方法


冰袋运输。效期一年。存储温度如下,切不可搞错!

Box I:2-8 °C保存;Box II:-20 °C保存。


注意事项


一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度

6. 针对大规格1000T,客户在使用前需提前复融,保证充分解冻且混匀。


二、应用范围

1 本产品仅作科研用途!

2. 本试剂盒适用于起始模板量为10 ng-4 μg(体积≤50 μL)的高质量动物、植物和真菌等真核生物的总RNA。如初始RNA浓度偏低,体积超过50 μL,可使用Hieff NGS® RNA Cleaner磁珠进行浓缩。RNA需通过Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico芯片检测,RIN值要求>7,以保证mRNA有完整的poly(A)尾结构。

3. 本试剂盒的mRNA分离模块使用的是oligo (dT)磁珠,只有带poly(A)尾的mRNA才能被提取;其他不具poly(A)尾的RNA,如非编码RNA、无poly(A)尾的mRNA等不能适用本试剂盒。此外,FFPE样本中的mRNA降解严重,通常无完整的poly(A)尾结构,故亦无法使用本试剂盒进行建库。

4. 本试剂盒所制备文库可进行多种RNA-Seq应用,包括:

基因表达(gene expression)

单核苷酸变异检测(single nucleotide variation discovery)

基因融合鉴定(gene fusion identification)

剪切变异体分析(splice variant analysis)

三、关于接头连接(Adapter Ligation)

1.本公司可提供长接头(Barcoded Adapter)试剂盒和短接头(也称为小Y接头、不完整接头)试剂盒,客户可根据实验需求进行选择。目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615-Cat#12618);双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#12414-12415)。

2.我们建议选用高质量的商业化接头,如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

3.使用接头时,请提前将接头取出放在4  °C或冰盒上解冻;室温操作时,实验室温度最好不要超过25°C,防止接头解链。

4.建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4 °C保存48 h。

表1 Input Total RNA量与接头浓度推荐表

Input Total RNA

Adapter stock concentration

10 ng

1 μM

100 ng

1.5 μM

500 ng

3 μM

≥1 μg

5 μM

四、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4 °C可保存2天,-20 °C可保存1个月。

五、关于文库扩增 (Library Amplification)

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司第二代高保真DNA聚合酶所组成,在第一代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

2. 如果您使用Indexed Adapter(也称为长接头、大Y接头),可使用本试剂盒提供的引物Primer mix进行扩增;如果使用的是“短接头”或者叫“小Y接头”,则需要使用index primers进行扩增,加上相应的barcodes。

3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表2列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA量与相应扩增循环数的推荐。

表2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA

Number of cycles

Non-stranded

Stranded

10 ng

15

15

100 ng

14

14

500 ng

12

13

1 μg

11

12

【注】:*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关,样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑,选择最合适的建库条件。

六、自备材料 (Other Materials)

1. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。

2. RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

3. Adapters:含Index的长接头 (Yeasen Cat#12615-12618)或者无Index的短接头试剂盒 (Yeasen Cat#12414-12415)。

4. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

5. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。


使用方法


一、自备材料

1.纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads (Cat#12601)或AMPure XP Beads (Cat#A63880)或其他等效产品。

2.RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

3.Adapters:barcoded adapter(长接头)或者无barcode的短接头试剂盒。

4.文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

5.其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。


二、操作流程

1639619740120664.png

图1 mRNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 mRNA纯化和片段化 (mRNA Purification and Fragmentation)

1. 将mRNA Capture Beads从2-8 °C取出,静置使其温度平衡至室温,约30 min。

2. 准备一个Nuclease free离心管,取10 ng-4 μg总RNA,用Nuclease Free水将体积补至50 μL,冰上放置备用。

3. 颠倒或旋涡振荡混匀磁珠,吸取50 μL磁珠悬液加入至50 μL总RNA样品中,用移液器吹打6次,使其充分混匀。

4. 将磁珠与RNA的混合物置于PCR仪中,65 °C,5 min;25 °C,5 min;25 °C,hold,完成RNA与捕获磁珠的结合。

5. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,使mRNA与总RNA分离,小心移除上清。

6. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀。将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

7. 重复步骤6,共洗涤两次。

8. 将样品从磁力架上取出,加入50 μL Tris Buffer重悬磁珠,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

9. 将样品置于PCR仪中,80 °C,2 min;25 °C,hold,将mRNA洗脱下来。

10. 将样品从PCR仪中取出,加入50 μL Beads Binding Buffer,用移液器反复吹打6次以彻底混匀。

11. 室温放置5 min,使mRNA结合到磁珠上。

12. 将样品置于磁力架中,室温静置5 min,小心移除上清。

13. 将样品从磁力架上取出,用200 μL Beads Wash Buffer重悬磁珠,移液器反复吹打6次以彻底混匀,将样品重新放回

至磁力架中,室温静置5 min,吸掉全部上清。

【注】:最后需要用10 μL移液器吸干净残留液体。

将样品从磁力架上取出,用18.5 μL Frag/Prime Buffer重悬磁珠,用移液器吹打6次以彻底混匀;将样品置于PCR仪中(预设为94 °C),可参考表3选择片段化程序,但不同物种片段化的效果有差异,客户可先根据自己的情况,做个片段化时间的梯度,比如94 °C,5 min。使用Agilent 2100分析mRNA纯化产物大小。


表3 片段化程序推荐

插入片段大小 (bp)

打断程序

200-300

94 °C,10 min

300-400

94 °C,7 min

400-500

94 °C,5 min

15. 片段化程序结束后,为防止poly(A)尾RNA与磁珠结合,请立即将样品置于磁力架中,待溶液澄清后,转移17 μL上清至一个新的Nuclease Free离心管中,立刻进入第一链cDNA合成。

3.2 第一链cDNA的合成

1. 将第一链合成试剂从-20°C取出,颠倒混匀后瞬离。按表4所示,配制第一链cDNA合成的反应液。

表4 第一链cDNA合成反应体系

名称

体积 (μL)

Fragmented mRNA

17

Strand Specificity Reagent

6

1st Strand Enzyme Mix

2

Total

25

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表5所示设置反应程序,进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表5 第一链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105 °C

On

25 °C

10 min

42 °C

15 min

70 °C

15 min

4 °C

Hold

3.3第二链cDNA的合成/末端修复/加A

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表6所示,配制第二链cDNA合成/末端修复/加A反应液。

表6 第二链cDNA合成反应体系

名称

体积 (μL)

1st Strand cDNA

25

2nd Strand Buffer ( dNTP or dUTP)*

30

2nd Strand Enzyme Master Mix

5

Total

60

【注】:*如构建普通mRNA文库,请使用含dNTP的Buffer;如构建链特异性mRNA文库,请使用含dUTP的Buffer。

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表7所示设置反应程序,进行第二链cDNA的合成。

表7 第二链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105 °C

on

16 °C

30 min

72 °C

15 min

4 °C

Hold

3.4 接头连接 (Adapter Ligation)

该步骤可在末端修复和dA尾添加的产物末端,连接特定的Illumina®接头。

1. 参考注意事项三中的表1,根据Input RNA量,稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表8中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

3. 于3.3步骤结束后的PCR管中继续配制表8所示反应体系。

表8 Adapter Ligation体系

名称

体积 (μL)

dA-tailed DNA

60

Ligation Enhancer

30*

Novel T4 DNA Ligase

5

DNA Adapter

5**

Total

100

【注】:*Ligation Enhancer使用前请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头原始浓度为15 μM, 请根据注意事项二表1的提示,根据投入量对接头进行稀释,使接头添加体积固定为5 μL。

4. 使用移液器轻轻吹打混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表9所示反应程序,进行接头连接反应:

表9 Adapter Ligation反应程序

温度

时间

热盖

Off

20 °C

15 min

4 °C

Hold

3.5连接产物纯化(Clean Up Post Ligation)

本方案适用于片段<200 bp时,通过两次纯化去除体系中的接头残留;当插入片段≥200 bp时,参照附录二的分选方案,通过纯化、分选或者直接分选获得目标长度的文库。

适用于插入片段<200 bp的文库(需进行两轮纯化):

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入52 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取50 μL上清至新PCR管中,再进行一轮纯化。

9. 吸40 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.8×,Beads:DNA=0.8:1)至上一步产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

10. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。

11. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

12. 重复步骤11,总计漂洗两次。

13. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

14. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行PCR扩增。

3.6 文库扩增 (Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表10中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。

表10-A  短接头连接产物PCR反应体系                              表10-B  长接头连接产物PCR反应体系

组分名称

体积(μL)


组分名称

体积 (μL)

2×Super Canace® II High-Fidelity Mix

25


2×Super Canace® II High-Fidelity Mix

25

Universal Primer/ i5 Primer*

2.5


Primer Mix**

5

Index Primer/ i7 Primer*

2.5


Adapter Ligated DNA

20


Adapter Ligated DNA

20

Total

50


Total

50

【注】:*如果使用的是无Index的接头,俗称短接头(小Y接头),请使用短接头试剂(Cat#12414~ Cat#12415)中配备的Index primer进行扩增。

**如果您使用的是Indexed Adapter (Cat#12615~ Cat#12618),俗称长接头(大Y接头),可用试剂盒中的Primer Mix进行扩增。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表11示反应程序,进行PCR扩增。

表11 PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98 °C

1 min

1

98 °C

10 sec

11~15 cycles *

60 °C

30 sec

72 °C

30 sec

72 °C

5 min

1

4 °C

Hold

-

【注】:*文库扩增循环数需根据样本质量、投入量等建库条件进行调整,详见表2。

3.7 扩增产物磁珠纯化(Clean Up Post Amplification)

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。

3.8 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。


附录一:片段化效果展示

1639619797480814.png

图2. mRNA不同打断时间对应的片段范围。分别以94 °C 10 min、94 °C 7 min和94 °C 5 min处理。打断后mRNA进行2.2x 磁珠纯化,通过Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

【注】:本结果使用的RNA是Agilent公司的Universal Human Reference RNA,若使用其他来源的RNA,最好优化打断时间。

附录二:分选条件说明

分选方案适用于94 °C,10 min、94 °C,7 min和94 °C,5 min片段化的RNA建库,可以获得插入片段大于200 bp的文库:

方案一:接头连接产物纯化后分选

image.png0.6× Hieff NGS® DNA Selection Beads接头连接产物的纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,准备进行双轮分选。

image.png双轮分选(以94 °C,7 min打断,分选文库大小为410 bp~510 bp为例,其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选)

当选择短接头(小Y接头)进行连接后纯化,使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)进行RNA建库时,分选比例参照表12进行,当选择长接头(大Y接头),使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)进行连接后纯化,分选比例参照表13进行。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据片段长度要求,参考表12,在上述100 μL DNA中加入第一轮分选磁珠65 μL (0.65×),涡旋或移液器吹打10次混匀。

室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中,残留1-2 μL溶液管底。

5. 参考表12向上清中加入第二轮分选磁珠15 μL (0.15×)。

6. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

7. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。

8. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

9. 重复步骤8。

10. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3 min)。

11. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

12. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

表12 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度(bp)

200~300

250~350

350~450

450~550

文库长度(bp)

260~360

310~410

410~510

510~610

打断条件

94 °C 10 min

94 °C 7 min

94 °C 7 min

94 °C 5 min

第一轮磁珠体积(μL)

80 (0.8×)

75 (0.75×)

65 (0.65×)

60 (0.6×)

第二轮磁珠体积 (μL)

15 (0.15×)

15 (0.15×)

15 (0.15×)

10 (0.1×)


表13 长接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度(bp)

200~300

250~350

350~450

450~550

文库长度(bp)

320~420

370~470

470~570

570~670

打断条件

94 °C 10 min

94 °C 7 min

94 °C 7 min

94 °C 5 min

第一轮磁珠体积(μL)

75 (0.75×)

70 (0.7×)

65 (0.65×)

60 (0.6×)

第二轮磁珠体积(μL)

15 (0.15×)

15 (0.15×)

15 (0.15×)

10 (0.1×)

【注】:表12、13推荐的双轮分选比例适用于Hieff NGS® DNA Selection Beads;表中“×”表示样品DNA体积。如所需文库插入片段主峰为300 bp时,若在短接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL;若在长接头连接之后分选,样品DNA体积为100 μL,则第一轮分选磁珠使用体积为0.65×100 μL=65 μL,第二轮分选磁珠使用体积为0.15×100 μL=15 μL。

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图3. 1 μg 293 total RNA,在94°C 10 min,94°C 7min和94 °C 5 min片段化后,根据表12推荐磁珠比例得到的文库大小

方案二:接头连接产物直接分选(以94 °C,7 min打断,分选文库大小为410 bp~510 bp为例说明,其他文库大小按推荐比例进行磁珠分选)

500 ng以上的总RNA做mRNA抓取后建库,推荐直接分选,体系比较粘稠,需要小心添加,RNA质量略差样本可能会有接头残留。

当选择短接头(小Y接头)进行连接后纯化,使用双端384种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)进行RNA建库时,分选比例参照表14进行,当选择长接头(大Y接头),使用Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4 (Cat#12615~Cat#12618)进行连接后纯化,分选比例参照表15进行。

1. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

2. 根据片段长度要求,参考表14,在上述100 μL的连接体系中加入第一轮分选磁珠20 μL (0.20×),涡旋或移液器吹打10次混匀。室温孵育10 min。

3. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移 100 μL上清到干净的离心管中,。

4. 参考表14向上清中加入第二轮分选磁珠10 μL (0.10×)。

5. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置10 min。

6. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约3 min),小心移除上清。

7. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

8. 重复步骤7。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约3 min)。

10. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

11. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约3 min),小心转移20 μL上清至干净管中。

表14 短接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度(bp)

200~300

250~350

350~450

450~550

文库长度(bp)

260~360

310~410

410~510

510~610

打断条件

94 °C 10 min

94 °C 7 min

94 °C 7 min

94 °C 5 min

第一轮磁珠体积(μL)

25 (0.25×)

25 (0.25×)

20 (0.2×)

18 (0.18×)

第二轮磁珠体积 (μL)

10 (0.1×)

10 (0.1×)

10 (0.1×)

10 (0.1×)

表15 长接头文库分选推荐磁珠比例

插入片段长度 (bp)

200~300

250~350

350~450

450~550

文库长度 (bp)

320~420

370~470

470~570

570~670

打断条件

94 °C 10 min

94 °C 7 min

94 °C 7 min

94 °C 5 min

第一轮磁珠体积(μL)

25 (0.25×)

20 (0.2×)

18 (0.18×)

18 (0.18×)

第二轮磁珠体积 (μL)

10 (0.1×)

10 (0.1×)

10 (0.1×)

10 (0.1×)


1639620058222965.png图4. 1 μg 293 total RNA,在94 °C 10 min、94 °C 7 min和94 °C 5 min片段化后,根据表14推荐磁珠比例得到的文库大小

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