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Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix 11204ES
物品单位 品牌
Yeasen
  • 货号:11204ES03
  • 发布日期: 2022-01-21
  • 更新日期: 2022-01-30
产品详细说明
产地
品牌 Yeasen
货号 11204ES03
用途范围
英文名称
纯度 %
CAS编号
规格 1ml
保质期
是否进口

产品信息

产品名称

产品编号

规格

储存

价格(元)

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Rox Provided Seperately)

11204ES03

1ml 

-20℃避光

180.00

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix (Rox Provided Seperately)

11204ES08

5×1ml

-20℃避光

740.00


产品描述

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。Mix中含有热启动Hieff® DNA Polymerase、SYBR Green I、dNTPs、Mg2+。使用时,仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR,大大简化操作过程,降低污染几率。本产品针对不同型号的实时荧光定量PCR仪,分别提供不同浓度的 Rox 参比液(High Rox/Low Rox),用于校正孔与孔之间的荧光信号误差。

本品采用的DNA聚合酶配体可以随温度变化实时调节DNA聚合酶活性。配方添加了有效抑制非特异性PCR扩增的因子和提升PCR反应扩增效率的因子,使定量PCR可以在宽广的定量区域内获得良好的线性关系。


产品组分

组分编号

组分名称

产品编号/规格

11204ES03(1 ml)

11204ES08(5×1 ml)

11204-A

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix

1 ml

1 ml×5

11204-B

50×Low Rox

40 μl

200 μl

11204-C

50×High Rox

40 μl

200 μl


运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存,有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR® Green I,保存或配制反应体系时需避免强光照射。


注意事项

1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒(货号:11123ES),以有效去除RNA样品中残留的基因组。

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

3.本产品仅作科研用途!


反应体系(推荐冰上配制)


组分

体积(μl)

体积(μl)

终浓度

Hieff® qPCR SYBR Green Master Mix

25

10

Forward Primer (10μM)

1

0.4

0.2μM

Reverse Primer (10μM)

1

0.4

0.2μM

50×High or Low Rox

1

0.4

模板DNA

X

X

-

无菌超纯水

to 50

to 20

-


【注】: 使用前务必充分混匀,避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 参比染料:Rox的添加,可根据不同仪器型号进行选择,具体可参考【适用机型】。

b) 引物浓度:通常引物终浓度为0.2μM,也可以根据情况在0.1-1.0μM之间进行调整。

c) 模板浓度:如模板类型为未稀释cDNA原液,使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

d) 模板稀释:cDNA原液建议5-10倍稀释,最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

e) 反应体系:推荐使用20μl或50μl,以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

f) 体系配制:请于超净工作台内配制,并使用无核酸酶残留的枪头、反应管;推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

 

扩增程序

       1625476380742389.png

【注】:高特异性可选择两步法,高效率扩增可选择三步法

a) 预变性时间:根据不同模板和引物的具体情况可适当缩短至2min。
b) 退火温度和时间:请根据引物和目的基因的长度进行调整。
c) 荧光信号采集(★):请参考仪器说明书设置。 
d) 熔解曲线:通常情况下可以使用仪器默认程序。


结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线:标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时,定量分析最准确;

Ct值小于10,需要将稀释模板后,重新进行实验;

Ct值介于30-35之间时,需要提高模板浓度,或者增大反应体系的体积,以提高扩增效率,保证结果分析的准确性;
  Ct值大于35时,检测结果无法定量分析基因的表达量,但可用于定性分析。

2) 熔解曲线

熔解曲线单峰,表明反应特异性好可以进行定量结果分析;若熔解曲线出现双峰或者多峰,则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰,需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体,建议降低引物浓度,或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增,请提高退火温度,或者重新设计更高特异性的引物。


引物设计指南

1)推荐引物长度25bp左右。扩增产物长度150bp为佳,可以在100bp-300bp内选择。

2)正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60oC-65oC为佳。

3)引物碱基分布要均匀,避免出现连续的4个相同碱基,GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4)引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5)引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6)设计完成的引物需要进行扩增效率的检测,只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。


适用机型


High Rox适用机型: ABI 5700, 7000, 7300, 7700, 7900HT Fast, StepOne, StepOne Plus;

Low Rox 适用机型:

ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio6,7,12k Flex; Stratagene MX3000P, MX3005P, MX4000P;  

不需要Rox校正的仪器型号:

Bio-Rad CFX96, CFX384, iCycler iQ, iQ5, MyiQ, MiniOpticon, Opticon, Opticon 2, Chromo4;

Eppendorf Mastercycler ep realplex, realplex 2 s; Qiagen Corbett Rotor-Gene Q, Rotor-Gene 3000, Rotor-Gene 6000;

Roche Applied Science LightCycler 480, LightCycler 2.0; Lightcycler 96; Thermo Scientific PikoReal Cycler;

Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR. 


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