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Hieff NGS® Universal Library Convert Kit 13342ES
物品单位 品牌
Yeasen
  • 产地:China
  • 货号:13342ES16
  • 发布日期: 2021-07-06
  • 更新日期: 2022-02-07
产品详细说明
产地 China
品牌 Yeasen
货号 13342ES16
用途范围
英文名称
纯度 %
CAS编号
规格 16T
保质期
是否进口

产品信息


产品名称

产品编号

规格

Hieff NGS® Universal Library Convert Kit

13342ES16

16 T

13342ES96

96 T


产品描述


该试剂盒可以将Illumina试剂盒构建的双链线性文库转化为兼容华大智造测序平台的环状ssDNA文库。构建的文库可使用BGISEQ-500RS、 MGISEQ-200RS 和 MGISEQ-2000RS 进行测序。

产品组分


组分编号与名称

ES16

ES96

13342-A

蓝色圈.png

AC-PCR Amplification mix

400 μL

1200 μL

13342-B

蓝色圈.png

AC-PCR Primer mix

16 μL

96 μL

13342-C

虚线白圈圈.png

App-A Splint Buffer

240 μL

2×720 μL

13342-D

虚线白圈圈.png

Ligase

80 μL

480 μL

13342-E

实线白圈.png

Digestion Buffer

130 μL

780 μL

13342-F

实线白圈.png

Digestion Enzyme

32 μL

192 μL


运输与保存方法


干冰运输。

所有组分-20°C保存,有效期1年。

*当运输条件、储存条件及使用方式都正确时,所有组分在有效期内均能保持完整活性。

注意事项


一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. 定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

二、样本要求及处理

2.1样本要求

1. 样本为线性dsDNA文库,接头序列符合下列之一:

单index:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-Insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'


双index:

5'-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-insert-AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-[i7]-ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'

2. 线性dsDNA文库插入片段范围为 100 ~ 500 bp,同时主带集中在±100 bp 以内。

2.2 样本量要求

 根据文库总量选择合适的线性dsDNA投入量,详见表1:

表1. 线性dsDNA总量与浓度要求

线性dsDNA文库投入量(ng)

线性dsDNA文库总量(ng)

线性dsDNA文库浓度要求(ng/μl)

10

≤25

>0.45

25

25<文库总量<50

1<文库浓度<2.1

50

>50

>2.1

2.3 转换PCR

不同线性 dsDNA 文库投入量,所需 PCR 循环也不相同,详见表2:

表2. 不同线性dsDNA投入量PCR循环数推荐表

线性dsDNA文库投入量(ng)

推荐PCR循环数

10

8

25

7

50

6

2.4 转换文库pooling要求

1. 不推荐在转换PCR前对线性dsDNA进行pooling。

2. 需将接头转换 PCR 产物混合测序,则 Sample Barcode Pooling 应遵循碱基平衡的原则:最佳平衡状态 ATGC 4种碱基的占比应分别为 25% ,若不能达到 25%,则要保证每个 cycle 都存在 ATGC 四种碱基序列,并且最少的碱基不应低于 12.5%,最多的碱基不应高于 62.5%。

3. 不同片段长度的文库不建议 pooling 环化。

4. 若样本所需数据量相同且长度相同,则可以等量混合,每个样本所需的质量按照公式1进行计算:

公式1混合样本中单个样本所需质量的计算

单个样本所需的质量 (ng)=1 pmol Input DNA 对应的质量 (ng/混合的样本个数 N

5. 混合后接头转换 PCR 产物总量为 1 pmol,总体积最多为 40 μL;若文库不足则用 TE buffer补充至 40 μL

、关于磁珠纯化(Bead-based Clean Up)

1. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致纯化得率下降。

2. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

3. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

4. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥约5 min。

5. 单链环产物纯化保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于-20°C可保存1个月。

四、关于文库质检

1. 转换文库推荐使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 或 Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit 等双链 DNA 进行定量, 要求最终接头转换 PCR产物的摩尔产量至少为 1 pmol,可根据公式2计算或参考表2。


公式2 PCR 产物摩尔数与质量间的换算

1 pmol PCR 产物对应的质量 (ng)=DNA 主片段大小 (bp)×0.66

表3. 不同片段大小PCR产物1 pmol对应产量

PCR产物主片段大小(bp)

1 pmol对应产量(ng)

300

198

350

231

400

264

450

297

500

330

2. 单链环产物纯化后推荐使用 Qubit® ssDNA Assay Kit 单链 DNA 荧光染料试剂对纯化后产物进行定量。
3. 单链环状 DNA 产物纯化后产量应达到 60 fmol 以上方足够一次上机测序的量,可根据公式3计算或参考表3 。

公式 3 单链环摩尔数与质量间的换算
60 fmol 单链环对应的质量 (ng)=0.06×DNA 主片段大小 (bp)×0.33

表4. 不同PCR产物片段大小对应60 fmol单链环产量

PCR产物主片段大小(bp)

60 fmol对应产量(ng)

300

5.94

350

6.93

400

7.92

450

8.91

500

9.90


使用方法


一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880,AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. 文库质控:Cat#12640,dsDNA HS Assay Kit for Qubit®或Cat#12642,1×dsDNA HS Assay kit for Qubit®或其他等效产品。

3. 单链环质控:Cat # Q10212, Thermo fisher Qubit® ssDNA Assay Kit或其他等效产品。

4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,pH 8.0-8.5+0.1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。


二、操作流程


1625103686962293.png


图1. 通用文库转换流程

三、操作步骤

Part A接头转换PCR

1、转换PCR

该步骤对线性dsDNA文库进行转换-转化为可以进行后续环化的线性dsDNA文库。

1. 将表5中试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表5所示反应体系。

表5. 转换PCR扩增反应体系

名称

体积(μL)

AC-PCR Amplification Mix

25

AC-PCR Primer Mix

1

线性dsDNA 文库


ddH2O


Total

50

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表6所示反应程序,进行PCR扩增。

表6. PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

98°C

1 min

1

98°C

10 sec

参照注意事项中表2

60°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

5 min

1

4°C

Hold

-

2、转换PCR产物纯化

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads : DNA=0.9:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:加入32 μL TE buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。

9. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移30 μL上清至干净的管中。

3、转换PCR产物质检

使用 Qubit® dsDNA HS Assay Kit 等转换PCR产物进行定量,具体请参见注意事项四。

Part B 转换文库环化

1 变性

1. 根据文库长度,取1 pmol 至 0.2 ml PCR 管中,用 TE Buffer 补充至总体积 40 μL。

4. 混匀后,在 PCR 仪上进行 98℃变性 3 min,之后立即置于冰上,冰浴 2 min 后瞬时离心。

2 单链环化

1. 将表7中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表7反应体系。

表7. 单链环化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

40

App-A Splint Buffer

15

Ligase

5

Total

60

3.使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表8所示摄制反应程序,进行单链环化反应。

表8. 单链环化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

15 min

4°C

Hold

3 酶切消化

1. 将表9中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于冰上配制表9所示反应体系。

表9. 酶切消化体系

名称

体积(μL)

上一步反应物

60

Digestion Buffer

8

Digestion Enzyme

2

Total

70

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪上,按照表10的条件进行反应:

表10.  酶切消化反应程序

温度

时间

热盖105°C

OFF

37°C

10 min

4°C

Hold

5. 反应结束后,瞬时离心,立即进行纯化。

4 消化产物纯化

该步骤使用磁珠对3.3步骤的产物进行纯化。

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads或 Beckman AMPure XP Beads由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取120 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads至消化产物中,室温孵育10min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约2 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入500μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入22 μL TE Buffer,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置10 min。

9. 短暂离心,将 PCR 管始终置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约 2min),将上清小心移至新 PCR 管中, -20℃保存,待制备 DNB。

5 消化产物质控

使用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光试剂对酶切消化产物进行定量,具体请参见注意事项四。

HB210630