欢迎光临翌圣生物科技(上海)股份有限公司!
tanhao@yeasen.com 021-34615995
产品搜索
产品导航
Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit 12304es
物品单位 品牌
Yeasen
  • 产地:China
  • 货号:12304ES08
  • 发布日期: 2021-05-20
  • 更新日期: 2022-02-07
产品详细说明
产地 China
品牌 Yeasen
货号 12304ES08
用途范围
纯度 %
CAS编号
规格 8T
是否进口

产品信息

 

产品名称

产品编号

规格

价格/元

Hieff NGS® Fast RNA   Library Prep Kit for Illumina®

极速RNA 建库试剂盒

12304ES08

8 T

4875

12304ES24

24 T

12675

12304ES96

96 T

42875

 

产品描述

 

Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®是用于Illumina®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒,包含宿主(人)rRNA去除试剂,RNA反转录试剂,常规ds-cDNA合成试剂,转座酶和优化的缓冲体系,以及文库扩增试剂。本产品利用专业开发设计的新一代转座酶可以完成8~10 ng ds-cDNA建库,简化了操作流程,将建库时间缩短到3 h。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于mNGS样本的建库。经测序验证,不同GC含量的样本,均可获得优异的测序结果,文库覆盖度高,均一性好,偏好性低,使建库变得更加简单高效。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,*程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

 

产品组分

1621476231569088.png

运输与保存方法

 

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

二、关于产品原理

本产品基于转座酶法开发,其核心原理是转座酶及其转座机制。在 Transposome Mix 中包含由转座酶和两种等摩尔的接头 Adapter 1 和 Adapter 2 构成一个完整的转座子。转座发生时,该转座子将 Adapter 1 和 Adapter 2 接头序列插入靶基因中, 形成一端带有 Adapter 1,一端带有 Adapter 2 的 DNA,之后利用 DNA 聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经 N5(N5XX) 和 N7(N7XX)以及 P5 和 P7(PCR Primer Mix)两对引物扩增,产物经分选和纯化后即为可测序文库。

 

1621476635854156.png


图1.Transposome的工作原理


三、关于ds-cDNA的片段化

1. 本产品的转座酶适用于长度>500 bp的DNA。因转座酶无法作用于DNA末端,因此 PCR 产物最末端 50 bp 测序覆盖度可能会有所降低。我们推荐您在制备 PCR 产物时将待测区域两末端各延长50-100 bp,以避免末端测序覆盖度降低。

2. 本试剂盒适用8~10 ng Input ds-cDNA。在 Input ds-cDNA 投入前,使用基于双链 DNA 荧光染料的方法,如 Qubit® ,PicoGreen®等进行定量。【注:Transposome Mix 对 DNA 浓度非常敏感,所以准确的 DNA 浓度测定对实验成功与否至关重要。】


四、DNA磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。


五、关于文库质检(Library Quality Analysis)

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR*定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR*定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。


六、自备材料(Other Material)

1. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads(A63880)或其他等效产品。

2. N5(N5XX)和 N7(N7XX)Index 引物: Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)(Cat#12610ES96)。

3. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

4. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

建库流程

1621476736172255.png 

 图2. 极速 RNA建库操作流程

使用方法

 

Step 1 宿主rRNA的去除

1. 将 Random Primer & rRNA Removal Mix室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。按照下表配置反应液:

表1.宿主rRNA去除反应体系

名称

体积(μL)

Random Primer & rRNA Removal Mix

2

RNA   (10 ng~500 ng)

13

Total

15

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表2所示设置反应程序,进行RNA的预变性。

表2.宿主rRNA去除反应程序

温度

时间

热盖   105°C

On

85°C

5 min

72°C

2 min

60°C

10 min

立即置于冰上

3 min


Step 2 
*链cDNA的合成(1st Strand Synthesis)

1. 将*链合成试剂从-20°C取出,室温解冻,颠倒混匀后瞬离。按表6所示,配制*链cDNA合成的反应液。

表3.*链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL)

变性的RNA

15

1st Reaction Buffer

8

1st Stand Enzyme Mix

2

Total

25

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表4所示设置反应程序,进行*链cDNA的合成。反应结束后立即进行*链cDNA的合成。


表4.*链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖 105°C

On

25°C

5 min

42°C

30 min

85°C

5 min

4°C

Hold


Step 3
*链cDNA的合成(2nd Strand Synthesis):

1. 将*链合成试剂从-20 °C取出,解冻后颠倒混匀;按照表5所示,配制*链cDNA合成反应液。

表5.*链cDNA合成反应体系

名称

体积(μL)

1st Strand cDNA

25

2nd Reaction Buffer

7

2nd Stand Enzyme Mix

3

Total

35

2. 使用移液器轻轻吹打混匀,瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中,按照表6所示设置反应程序,进行*链cDNA的合成。

表6.*链cDNA合成反应程序

温度

时间

热盖   Off

on

16°C

30 min

4°C

Hold


Step4 cDNA
产物纯化(Post Ligation Clean Up)

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取21 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至*链cDNA产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入14 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取12 μL上清至新PCR管中,取1 μL的纯化测*链cDNA产物进行Qubit 定量,进行转座酶的片段化。


Step 5 DNA
片段化(DNA Tagment)

1. 准备工作:将 Hieff NGS® DNA Selection Beads 磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少 30 min。配制 80%乙醇。将 5×Reaction Buffer 室温解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌 PCR 管中配制表 7 所示反应体系。

表7.片段化反应体系

名称

体积(μL)

2nd Strand cDNA纯化产物

8~10 ng

5×Reaction Buffer

4

Transposome Mix V1

5

Add ddH2O

 /

Total

20

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表8所示反应程序,进行DNA片段化,末端修复及dA尾添加反应。

表8.片段化的反应程序

温度

时间

热盖105°C

on

55°C

10 min

4°C

Hold


Step 6 
文库扩增(Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表8中的试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表9所示反应体系。

表9.文库扩增PCR反应体系

组分名称

体积(μL)

片段化产物

20

PCR Primer Mix

3

N5XX*

1

N7XX*

1

2×Ultima Amplification Mix

25

Total

50

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中,设置表10示反应程序,进行PCR扩增。

表10.文库扩增PCR扩增反应程序

温度

时间

循环数

72°C

3 min

1*

95°C

1 min

1

95°C

10 sec

13~15 cycles**

55°C

30 sec

72°C

30 sec

72°C

1 min

1

4°C

Hold

-

注意:*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链 DNA,72℃孵育 3 min 用于生成成熟的 PCR 模板。

**循环数请根据测序需要进行选择。起始 DNA 量为 8-10 ng 时,推荐 13-15 个扩增循环。


Step 7 
扩增产物磁珠纯化(Post Amplification Clean Up)

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.9×,Beads:DNA=0.9:1)至PCR产物中,涡旋或吹打混匀,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约3 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,进行文库定量、质检。


Step 8 
文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项五。

附录

使用Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®对50 ng ~500 ng 293 RNA样本建库,使用0.9×磁珠进行PCR后纯化,结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

 徐正图3.jpg

 图3.极速 RNA建库峰图

HB210507