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Hieff NGS® Illumina平台双模RNA建库试剂盒 12252ES
物品单位 价格 品牌
3672 Yeasen
  • 产地:China
  • 型号:8 T/盒
  • 货号:12252ES08
  • 发布日期: 2021-05-20
  • 更新日期: 2022-03-23
产品详细说明
产地 China
品牌 Yeasen
货号 12252ES08
用途范围 RNA建库
纯度 %
CAS编号
别名 双模RNA建库试剂盒
规格 8 T/盒
分子式
产品英文名称 Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina®
是否进口

产品信息


产品名称

产品编号

规格

价格/元

Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina®

双模式RNA 建库试剂盒

12252ES08

8 T

3672.00

12252ES24

24 T

9272.00

12252ES96

96 T

29772.00

产品描述


Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Library Prep Kit for Illumina®是用于Illumina®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒,包含RNA|片段化试剂,反转录试剂,常规和链特异性ds-cDNA合成试剂,以及文库扩增试剂。可以衔接mRNA纯化试剂盒或rRNA去除试剂盒构建测序文库。二链合成模块配有两种Buffer,客户可根据需要进行常规建库或链特异性建库。其中链特异性二链合成Buffer中将dTTP替换为dUTP,使cDNA*链中掺入dUTP,而本试剂盒使用的高保真DNA聚合酶无法扩增含尿嘧啶的DNA模板,实现链特异性。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证,*程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。

产品组分


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运输与保存方法


干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

注意事项


一、 关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材,并对实验区域定期进行清理,推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;配备文库构建专用移液器等设备;定时对各实验区域进行清洁(推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾),以保证实验环境的洁净度。

二、关于接头连接(Adapter Ligation)

1. 本公司可提供长接头(Indexed Adapter)试剂盒和短接头(也称为小Y接头、不完整接头)试剂盒,客户可根据实验需求进行选择。

目前有48种Indexed Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4(Cat#12615~Cat#12618);双端 384 种 Index Primers: Hieff NGS® RNA 384 CDI Primer for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12414~Cat#12415)。

2. 我们建议选用高质量的商业化接头。如客户使用自制接头,请委托具有NGS引物合成经验的公司,并备注需进行严格的防污染控制。此外,进行接头退火操作时,请在超净台完成。每次只操作一种接头,防止交叉污染。

3. 使用接头时,请提前将接头取出放在4°C或冰盒上解冻;在室温操作时,实验室温度*不要超过25°C,防止接头解链。

4. 建库过程中,接头浓度过高或过低都会导致建库成功率变低。本试剂盒操作方案中,所加入的接头体积固定为5 μL,请根据初始的RNA投入量,参考表1对接头进行稀释。本公司接头原始浓度均为15 μM,接头稀释液请选择0.1×TE buffer,稀释过的接头可在4°C保存48小时。

表1 Input Total RNA量与接头使用浓度推荐表

Input Total RNA

Adapter stock concentration

10 ng

1 μM

100 ng

1.5 μM

500 ng

3 μM

≥1 μg

5 μM

三、关于文库扩增(Library Amplification )

1. 本试剂盒中的文库扩增组分由本公司*代高保真 DNA 聚合酶所组成,在*代的基础上,大大增强了扩增的均一性,即使是低拷贝的基因,也能进行无偏好性地扩增。

2. 如果您使用 Indexed Adapter(也称为长接头、大 Y 接头),可使用本试剂盒提供的引物 Primer mix 进行扩增;如果使用的是“短接头”或者叫“小 Y 接头”,则需要使用 Index Primers 进行扩增,加上相应的 Index。

3. 文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足,将导致文库产量低;循环数过多,又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表 2 列举了使用本试剂盒进行文库扩增,Input Total RNA 量与相应扩增循环数的推荐。

4. 表2中推荐的循环数可满足绝大多数建库需求,若您的样本质量较差(如降解严重的FFPE样本),可根据实际情况适当增加循环数。mRNA建库时请特别注意,由于不同物种和组织所提取的 Total RNA中,mRNA的含量差异较大,实验中需根据建库起始量、物种类型及样本处理情况适当调整扩增循环数。

表 2 Input Total RNA 量与扩增循环数推荐表*

Input Total RNA

Number of cycles

Non-stranded

Stranded

10 ng

15

15

100 ng

14

14

500 ng

12

13

1 μg

11

12

【注】:*由于文库产量不仅与投入量和扩增循环数相关,样本质量、片段化条件、分选条件等都会影响产量。建库过程中请根据实际情况综合考虑,选择*的建库条件。

四、DNA磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠,我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用0.1×TE Buffer洗脱,产物于4°C可保存2天,-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检(Library Quality Analysis)

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR*定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物;qPCR*定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料(Other Material)

1. mRNA富集试剂盒:Hieff NGS® mRNA Isolation Master Kit(Yeasen Cat#12603)。

2. rRNA去除试剂盒:Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) (Yeasen Cat#12253)。

3. RNA纯化磁珠: Hieff NGS® RNA Cleaner(Yeasen Cat#12602)或其他等效产品。

4. DNA纯化磁珠:Hieff NGS® DNA Selection Beads(Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads(A63880)或其他等效产品。

5. RNA质控:Agilent 2100 Bioanalyzer RNA 6000 Nano/Pico Chip或其他等效产品。

6. Adapters:含Index的长接头(Yeasen Cat#12615~12618)或者无Index的短接头试剂盒(Yeasen Cat#12414-12415)。

7. 文库质检:Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品;文库定量试剂。

8. 其他材料:无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。


建库流程图


图片.png

图1 RNA建库操作流程

HB210512