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Hieff NGS® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit 12209
物品单位 品牌
Yeasen
  • 产地:China
  • 货号:12209ES08
  • 发布日期: 2021-05-12
  • 更新日期: 2022-01-30
产品详细说明
产地 China
品牌 Yeasen
货号 12209ES08
用途范围
英文名称
纯度 %
CAS编号
规格 8T
保质期
是否进口

产品信息

产品名称

产品编号

规格

价格/元

Hieff NGS® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina®

12209ES08

8 T

1575.00

12209ES24

24 T

5375.00

12209ES96

96 T

18875.00


产品描述

Hieff NGS® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina®是针对Illumina®高通量测序平台专业开发设计的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较,本品采用高质量的片段化酶,摆脱了繁琐的超声过程,同时简化了操作流程,将片段化模块与末端修复模块合二为一,极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率,可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本,同时能兼容FFPE DNA样本的建库。改进版试剂盒使用了*优化的连接酶,极大的改善了接头连接时的片段自连现象。
橙点.png 适用500 pg - 1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本
橙点.png 高质量片段化酶,可随机切割双链DNA,酶切片段无偏好性
橙点.png 片段化、末端修复/加A一步完成
橙点.png 适用于FFPE DNA样本
橙点.png 严格的批次性能与稳定性质控

产品组分


组分编号与名称

12209ES08

12209ES24

12209ES96

12209-A

huang.png

Smearase® Buffer

80 μL

240 μL

960 μL

12209-B

huang.png

Smearase® Enzyme

40 μL

120 μL

480 μL

12209-C

lan.png

Ligation Enhancer

240 μL

720 μL

3×960 μL

12209-D

lan.png

Novel T4 DNA Ligase

40 μL

120 μL

480 μL


运输与保存方法

冰袋运输。所有组分-20°C保存,有效期1年。

注意事项


一、关于操作

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀,短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡,剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染,推荐使用带滤芯的枪头,吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应,使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染,进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离;使用专用的移液器等设备;并定时对各实验区域进行清洁(使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理),以保证实验环境的洁净度。

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒兼容范围为500 pg - 1 μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐,可能会影响后续实验,建议将DNA稀释在TE(10 mM Tris-HCl ,1 mM EDTA,pH 8.0)中进行片段化

3. 对于常规的高质量基因组DNA,酶切时间参考表4,本试剂盒片段化偏好低,耐受各种GC含量的模板。对于不同降解程度的FFPE样本,酶切时间参考表5。以上为推荐时间,需客户在自己的实验体系中进行微调,以达到*效果。

4.为保证优质精确的片段化效果,片段化反应配制过程请于冰上操作。

5. 针对FFPE DNA建库,若样本质量不佳,客户对当前建库产量不满意,可选购我公司的FFPE DNA Repair Reagent (Cat#12606)对FFPE DNA进行修复,具体使用方法可参考此产品说明书。该试剂可与片段化末修加A过程同时进行,无需额外的操作。

三、关于接头连接(Adapter Ligation)

1. 针对Illumina®测序平台,Yeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4(Cat#12615~Cat#12618);单端 96种 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612);双端384 种UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®(Cat#12404~Cat#12407)。

2. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer;用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒,不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

表1  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

Input DNA

Adapter : Input DNA摩尔比

Input DNA

Adapter : Input DNA摩尔比

1 μg

10:1

50 ng

100:1

500 ng

20:1

25 ng

200:1

250 ng

40:1

1 ng

200:1

100 ng

100:1

500 pg

400:1

【注】:Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)]。


四、关于磁珠纯化与分选(Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前,或接头连接后,或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng,您可选择在接头连接后分选;如Input DNA质量<50 ng,建议您在文库扩增后进行分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG,会对双轮分选产生显著影响。因此,如在接头连接后进行长度分选,必须先进行纯化步骤,再进行双轮分选步骤;如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选,可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温,否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时,请勿吸取磁珠,即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配,否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时,初始样品体积应尽量≥100 μL,不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应;过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下,室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱,产物可于4°C可保存1-2周,-20°C可保存1个月。

六、关于文库质检(Library Quality Analysis)

1. 通常情况下,构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用:基于双链DNA荧光染料的方法,如Qubit®、PicoGreen®等;基于qPCR*定量的方法。

3. 文库浓度检测不可使用:基于光谱检测的方法,如NanoDrop®等。

4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测:Qubit®、PicoGreen®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时,无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物;qPCR*定量基于PCR扩增原理,仅定量样品中两端Adapter完整的文库(即可测序的文库),可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

5. 文库长度分布检测,可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

使用方法


一、自备材料

1. 纯化磁珠:Cat#12601,Hieff NGS® DNA Selection Beads或Cat#A63880AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控:Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA AdapterYeasen提供48种Barcoded Adapters: Hieff NGS® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 4(Cat#12615~Cat#12618);单端 96种 Index Primers: Hieff NGS® 96 Single Index Primers Kit for Illumina® , Set 1~Set 2 (Cat#12611~Cat#12612);双端384 种UDI Primers: Hieff NGS® Stubby UDI Primer Kit for Illumina®(Cat#12404~Cat#12407)。或其他等效产品。

4. 其他材料:无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer(10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA ,pH 8.0)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

1620715941980721.png

图1.OnePot Pro PCR-Free DNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 DNA片段化/末端修复/dA尾添加(DNA Fragment/End Preparation/dA-Tailing)

该步骤将基因组DNA片段化,同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表2中各试剂解冻后,颠倒混匀,置于冰上备用。

2. 冰上配制表2反应体系。

表2.DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

名称

体积(μL)

Input DNA

x

Smearase® Buffer

10

Smearase® Enzyme

5

TE

Up to 60

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀,并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪,设置表3所示反应程序,进行DNA片段化,末端修复及dA尾添加反应。

表3  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

温度

时间

热盖105°C

On

4 °C

1 min*

30 °C

3-20 min**

65 °C

20 min

4 °C

Hold

【注】:*DNA片段化过程为有效控制片段化效果,避免过度酶切,反应程序可预先设置4°C,待模块温度降至4°C时,将PCR管放入PCR仪即可。**对于完整的基因组DNA,酶切时间参考表4,Input DNA 500-1000 ng,可根据需求,适当延长酶切时间2-4 min左右;对于质量不一的FFPE DNA样本,酶切时间参考表5。


表4.常规基因组DNA片段化时间选择表

入片段主峰大小

片段化时间

优化范围

600 bp

8 min

6-12 min

350 bp

10 min

8-14 min

250 bp

12 min

10-15 min

200 bp

15 min

13-18 min

150 bp

20 min

15-25 min


表5.FFPE DNA片段化时间选择表

插入片段主峰大小

片段化时间

DIN*

250 bp

9-13 min

> 8.0

250 bp

8-11 min

6.5-8.0

250 bp

4-8 min

4.2-6.5

250 bp

3-6 min

2.5-4.2

【注】:*DIN为DNA Integrity Number,是用Agilent 2200来定义FFPE DNA降解程度的一种方法,详见图2。

1620716245872701.png

图2.Agilent 2200定义不同降解程度样本的DIN值

3.2 接头连接(Adapter Ligation)

该步骤将3.1步骤的产物末端,连接特定的Illumina®接头。

1. 根据Input DNA量按表1稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表6中各试剂解冻后颠倒混匀,置于冰上备用。

3. 于3.1步骤PCR管中配制表6所示反应体系。

表6.Adapter Ligation PCR体系

名称

体积(μL)

dA-tailed DNA(3.1步骤产物)

60

Ligation Enhancer

30*

DNA Adapter

5**

Novel T4 DNA Ligase

5

【注】:*Ligation Enhancer比较粘稠,请上下颠倒、振荡,充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致,皆为15 μM

【接头添加计算举例】当Input DNA为100 ng,Input DNA长度为300 bp时,接头应该添加*?

*步:计算Input DNA摩尔数。公式:Input DNA摩尔数(pmol)≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度(bp)];

Input DNA摩尔数(pmol)=100÷(0.66×300)=0.5 pmol;

*步:计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表1查询接头添加比例;

根据表1,查得Input DNA 100 ng时接头添加比例100:1,则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol;

第三步:计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L(如使用其他接头,浓度需要依据其他接头浓度参数);

接头添加体积=接头添加摩尔数(50 pmol)÷接头浓度(15 μmol/L)=3.34 μL(注:15 μmol/L=15 pmol/μL)

综上,接头可添加3.4 μL,加1.6 μL水补齐至5 μL。(注:接头*加入体积不超过5 μL)。

4. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀,并短暂离心将反应液收集至管底。

5. 将PCR管置于PCR仪中,设置表7所示反应程序,进行接头连接反应。

表7.Adapter Ligation PCR反应程序

温度

时间

热盖105°C

Off

20°C

15 min

4°C

Hold

【注】:当Input DNA量较低,实验效果不理想时,可尝试将连接时间延长一倍。

3.3 连接产物磁珠纯化(Post Ligation Clean Up)

该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。

3.3.1 纯化操作步骤:

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取60 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads(0.6×,Beads:DNA=0.6:1)至Adapter Ligation产物中,室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec后,小心移除上清。

6. 重复步骤5,总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中,开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂(不超过5 min)。

8. 将PCR管从磁力架中取出,进行洗脱:

1)如产物无需进行片段分选,直接加入21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取20 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。

2)如产物需进行双轮分选,加入102 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀,室温静置5 min。【注:如纯化产物如需保存,可使用TE Buffer洗脱】。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置,待溶液澄清后(约5 min),小心移取100 μL上清至新PCR管中,切勿触碰磁珠。

3.3.2 双轮分选操作步骤:

1. 准备工作:将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出,室温平衡约30 min。配制80%乙醇。

2. 请涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证混匀。

3. 根据DNA片段长度要求,参考表8向上述100 μL DNA上清中加入*轮分选磁珠,涡旋混匀或移液器吹打10次混匀。

表8.磁珠文库分选推荐比例

DNA文库插入片段大小

150-250   bp

200-300   bp

300-400   bp

400-500   bp

500-600   bp

DNA文库大小

250-350   bp

350-450   bp

450-550   bp

550-650   bp

650-750   bp

*轮体积比(Beads:DNA)

0.80×

0.70×

0.60×

0.55×

0.50×

*轮体积比(Beads:DNA)

0.20×

0.20×

0.20×

0.15×

0.15×

【注】:表中“×”表示样品DNA体积。如文库插入片段长度为250 bp,样品DNA体积为100 μL,则*轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL;*轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL;表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA(Post Ligation),如果用户在接头连接前进行分选,请采用Hieff NGS® DNA Selection Beads(Cat#12601)说明书中推荐的比例。

4. 室温孵育5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心转移上清到干净的离心管中。

6. 参考表8向上清中加入*轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀,室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中,待溶液澄清后(约5 min),小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中,加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠,室温孵育30 sec,小心移除上清。

10. 重复步骤9。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中,开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂(约5 min)。

12. 将PCR管从磁力架中取出,加入适量21 μL ddH2O,涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀,室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后(约5 min),小心转移20 μL上清至干净的管中。

3.4 文库质量控制

通常情况下,构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价,具体请参见注意事项六。

3.5 参考实例

使用Hieff NGS® OnePot Pro PCR-Free DNA Library Prep Kit for Illumina®对200 ng Human gDNA (NA12878) 样本进行酶切建库检测,片段化结果见图3。

1620716482633396.png

图3.OnePot Pro PCR Free DNA建库试剂盒酶切200 ng Human gDNA样本(不同酶切时间片段化效果检测)

HB210203