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Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶)20585ES
物品单位 价格 品牌
856 Yeasen
  • 产地:China
  • 货号:20585ES01
  • 发布日期: 2020-03-23
  • 更新日期: 2020-03-23
产品详细说明
产地 China
品牌 Yeasen
货号 20585ES01
用途范围 蛋白纯化
纯度 %
CAS编号
规格 100 μL
是否进口

产品信息

产品名称      

产品编号

规格

储存

价格(元)

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶

20585ES01

100 μL

-20℃

856.00

Anti-DYKDDDDK (Flag)   Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶)

20585ES03

1 mL

-20℃

1936.00

Anti-DYKDDDDK (Flag)   Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶)

20585ES08

5 mL

-20℃

6236.00

Anti-DYKDDDDK (Flag)   Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶)

20585ES25

25 mL

-20℃

27286.00

Anti-DYKDDDDK (Flag)   Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶)

20585ES60

100 mL

-20℃

96756.00


产品描述

Anti-Flag亲和纯化凝胶(Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel)由高质量的鼠源IgG2b单*抗体与Sepharose 4B gel通过供价偶联制备,本产品具有较高的Flag标签融合蛋白加载容量(至少为1.1 mg protein/mL凝胶),杂蛋白非特异结合少,可用于带有Flag标签的融合蛋白免疫沉淀(IP)和纯化。

Anti-DYKDDDDK (Flag) Affinity Gel(Anti-Flag亲和纯化凝胶)可结合Met修饰的N端Flag融合蛋白(Met-FLAG–Protein ),N端Flag融合蛋白(FLAG–Protein),C端Flag融合蛋白(Protein-FLAG)。

*号(Clone)

1E6

亚型(Isotype)

Mouse   IgG2b

纯化方法(Purity)

Protein A

抗体浓度(Antibody   Concentration)

7.5 g抗体/L凝胶

应用(Application)

蛋白纯化, 免疫沉淀(IP)

蛋白结合量(Protein)

≥1.1 mg蛋白/mL凝胶

储存缓冲液(Buffer)

10mM Na3PO4,150mM   NaCl,50%甘油,pH7.4,含有0.02%(w/v)叠氮钠


产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。未开封的产品在-20℃下可稳定保存1年。禁止在不含甘油的溶液中冻存!


注意事项

1)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

 

使用方法

一、制备细胞裂解液(以哺乳动物细胞为例)

注意:样品中不能含有颗粒不溶物,可以用0.22 μm滤膜过滤或10,000×g离心15 min;如有必要,可以加入蛋白酶抑制剂;如样品太粘稠,可以加入核酸酶处理。

细胞密度70-90%,100 mm培养皿(约106- 107细胞),加入1mL裂解液(50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl,1 mM EDTA ,1%Triton X-100)。推荐加入蛋白酶抑制剂Cocktail(Cat 20123ES)。

1)清洗细胞

贴壁细胞:去除生长培养基,用PBS洗2次,去除PBS,加入裂解液(106-107 cells/mL)

悬浮细胞:细胞转移到离心管中,420×g 离心5 min,去除上清。用PBS重悬,420×g离心5 min,重复1次,去除上清,加入裂解液重悬(106-107 cells/mL)。

2)加入裂解液后,孵育15-30 min。

3)离心,12,000×g,10 min。【贴壁细胞离心前先把细胞刮下来】

4)收集上清到预冷的样品管中。上清可储存在-70℃。

二、应用

可以使用层析柱或免疫沉淀(IP)纯化目的蛋白。1-3 m L凝胶层析柱可以纯化约 100 mL细胞裂解 液;如样品体积较小(1-2 mL细胞裂解液),可以使用免疫沉淀(IP) 法;如需处理较大体积细胞裂解液,推荐使用溶液体系。

1层析柱法

1.1 装柱

1)准备层析空柱(Cat 20520ES-20526ES);用2-3倍柱体积的TBS(50 mM Tris-HCl,pH 7.4,150 mM NaCl)或其他适合缓冲液洗柱2次。

2)颠倒混匀Anti-Flag 亲和纯化凝胶,保证凝胶均一。取1-3 mL凝胶装柱(纯化约100 mL细胞裂解液)。
3)用2-3倍柱体积的TBS洗2次,待液体流尽后,用3倍体积的0.1 M 
Gly-HCl ,pH 3.5冲洗,要保证凝胶平面平整。Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20 min。

4)用5倍体积TBS平衡凝胶柱,直至流出液达到中性pH。

1.2 纯化

1)上样:在层析柱中加满蛋白裂解液 ,重复上样2-3次可以尽可能增加蛋白与凝胶结合量。

2)清洗:用10-20倍柱体积的TBS清洗,以去除非特异结合的蛋白。

3)洗脱(可选以下2种方法之一):

A、酸洗脱:收集管中加入15-25 μL 1 M Tris,pH 8.0,分别用1 mL 0.1 M Gly-HCl,pH 3.5洗脱,再重复5次。

B、3×Flag多肽(Cat 20571ES)洗脱:用TBS配制Flag多肽溶液(100 μg/m L)洗脱,分别用1倍柱体积多肽溶液洗脱,重复4次。

1.3 填料再生与保存

1)柱再生:使用后立即再生,用3倍柱体积0.1 M Gly-HCl,pH3.5清洗,立即用TBS平衡,直至达到中性pH.

2)保存:用10倍柱体积TBS(含50%甘油,0.02%叠氮钠)清洗,再加入5 mL该溶液至柱中,保存在2-8℃或-20℃中。

2免疫沉淀(IP)    

2.1免疫沉淀(IP)

1)充分重悬Anti- Flag 亲和纯化凝胶,尽量形成均一的溶液。取40 μL混合液(20 μL gel)至新的离心管中。

2)5,000-8,200 ×g 离心30 s,使凝胶沉淀在离心管底部,在加入样品前,静置1-2 min。去除上清,此时要小心操作,避免吸到凝胶。

3)加入500 μL  TBS,轻轻的重悬Anti-Flag Affinity Gel,10,000 rpm离心30 s,弃上清,重复上述步骤1次。
4)可选步骤。为去除凝胶中痕量的未结合抗体,可加入500 μL 0.1 M glycine HCl,pH 3.5清洗凝胶,离心去除上清,加入3倍体积TBS,轻摇2-3分钟,5,000-8,200×g离心30 s,弃上清,重复洗涤至上清pH为中性。Glycine HCl处理时间切勿超过20 min。
5)加入200-1000 μL细胞裂解液,如有必要,可用裂解液调整至终体积1 mL。细胞裂解液的体积取决于Flag融合蛋白的表达量。阳性对照,需要加入1 mL TBS和4 μL 50 ng/μL Flag-BAP融合蛋白(约200 ng);阴性对照,只要加入1 mL裂解缓冲液即可(不含蛋白)。

6)4℃缓慢孵育2小时。如需提高结合效率,可延长至过夜。

7)5,000-8,200×g 离心30 s,去除上清。

8)上述沉淀用0.5 mL TBS,轻摇混匀,5,000-8,200×g离心30 s去尽上清,重复3次。

2.2 Flag融合蛋白洗脱(可选以下3种方法之一)

1)非变性洗脱( Flag多肽)

a. 配制3×Flag多肽洗脱液 :用0.5 M Tris-HCl溶液,pH 7.5(含1M NaCl )溶解3×Flag多肽,终浓度为25 μg/μ L。用ddH2O稀释至5 μg/μL,加入3 μL 5 μg/μ L的3×Flag多肽,加入到100 μ L TBS中(终浓度150 ng/μL)。

b. 分别加入100 μL 3×Flag多肽洗脱液,4℃孵育30 min(慢慢摇晃), 5,000-8,200×g离心30 s, 转移上清至新管中(不要吸到凝胶)。如立即使用,上清可保存在4℃,-20℃长期保存。

2)酸性洗脱(0.1 M Gly-HCl,pH 3.5

加入100 μL 0.1 M Gly-HCl,pH 3.5,室温孵育5 min(慢慢摇晃),5,000-8,200×g离心30 s,转移上清至新管中(含10 μL 0.5 M Tris-HCl,pH 7.5,1.5 M NaCl)。注意不要吸到凝胶。如立即使用,上清可保存在4℃,-20℃长期保存。

3)用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱

加入20 μL  上样缓冲液(125 mM Tris-HCl,pH 6.8,4% SDS,20%甘油,0.004%溴酚蓝),煮沸3 min,5,000-8,200×g离心30 s。上清可直接SDS-PAGE电泳,或WB检测。

2.3 填料再生与保存

1)再生:使用后立即再生,加入3倍凝胶体积0.1 M Gly-HCl,pH3.5,轻摇3-5 min,5,000-8,200×g离心30 s,弃上清。立即用TBS平衡:加入3倍体积TBS,轻摇2-3 min,5,000-8,200×g离心30 s,收集上清测定pH,如为中性(原TBS加入前pH),则进行下一步,如仍为酸性,则重复平衡步骤。

2)保存:用10倍凝胶体积TBS(含50%甘油,0.02%叠氮钠)清洗,再加入适量该保存溶液至填料中,保存在2-8℃或-20℃中。保存缓冲液添加量,恢复至纯化前即可,体积比胶:缓冲液=1:1,可以增大缓冲液体积,缓冲液主要是提供必要的pH值和避免-20℃结冰。

3溶液体系
1)调整蛋白裂解液pH至pH 7-8,含有0.15 M盐离子,如NaCl,可以降低非特异性蛋白结合。需去除
Flag融合蛋白 裂解液中的不溶成分。
2)重悬Anti-Flag亲和纯化凝胶,转移至新离心管中。3倍体积TBS,轻摇2-3 min,5,000-8,200×g离心30 s,弃上清,重复洗涤至上清pH为中性。
3)Flag融合蛋白
裂解液 Anti-Flag亲和纯化凝胶 孵育1 h,在孵育过程中轻摇,以保证蛋白与凝胶充分接触。可根据情况,调整孵育时间。

4)1,000×g离心5 min收集凝胶-Flag融合蛋白;

5)用10-20倍柱体积的TBS清洗凝胶,以去除非特异蛋白。

6)洗脱Flag融合蛋白 【参照上述洗脱步骤】。

7)填料再生和保存【参照上述步骤】。

实验提示:
1)酸性洗脱时,Gly-HCl缓冲液处理时间不要超过20 min。
2)上样缓冲液中不要加入还原剂(如DTT),还原剂会破坏抗体,如必须要加还原剂,则2×上样缓冲液中还原剂不能超过10%或100 mM。

3)上样缓冲液中SDS会破坏抗体,所以Anti-Flag亲和纯化凝胶不能重复使用。

4)纯化推荐将凝胶装入层析柱中,所有溶液可以直接流过。若在管中,需反复离心除去溶液,操作繁琐。

5)除样本和裂解液外,其它溶液建议3倍体积,重复3次。可在保证纯化效果基础上适当缩减重复次数。

6)建议同时做阳性与阴性对照组。