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GST标签蛋白纯化预装柱,5ML 20510ES
物品单位 价格 品牌
938 Yeasen
  • 产地:China
  • 货号:20510ES08
  • 发布日期: 2020-03-20
  • 更新日期: 2020-03-20
产品详细说明
产地 China
品牌 Yeasen
货号 20510ES08
用途范围
纯度 %
CAS编号
规格 5mL
是否进口

产品信息

产品名称      

产品编号

规格

储存

价格(元)

GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML

GST标签蛋白纯化预装柱,5ML

20510ES08

5mL

4℃

938.00

20510ES25

5×5mL

4℃

3928.00


产品描述

GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF是一种GST标签蛋白纯化树脂,可以一步纯化各种表达系统中谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽依赖性蛋白和谷胱甘肽重组衍生物。在结构上,该树脂是以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质,通过12个原子的间隔臂,用化学方法共价结合还原型谷胱甘肽制作而成,具有更高的物理化学特性,可以耐受更高的压力,在相对较高的流速下,实现对目的蛋白的纯化,更适于工业大规模蛋白的纯化。

GSTSep Glutathione 4FF Chromatography Column, 5ML是装填了GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF的一种中压预装柱,规格5 mL,预装柱具有标准接口,可以适配商品化的各类中压色谱系统,如?KTA 等,方便客户操作。


产品性质

基质(Matrix)

高度交联的4%琼脂糖微球

配体(Ligand)

通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽

粒径(Bead size)

45-165 μm

载量(Capacity)

>10 mg GST protein/mL基质(40 kDa)

*压力(PressureMax)

0.3 MPa, 3bar

pH稳定范围(pH range)

3-12

储存缓冲液(Buffer)

20%乙醇


运输和保存方法

冰袋运输。4℃保存,有效期2年。

需准备试剂

所用水和Buffer在使用前*用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤除菌。

结合/洗杂缓冲液:PBS,pH 7.4(140 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na2HPO4,1.8 mM KH2PO4,pH 7.4)

洗脱缓冲液:50 mM Tris-HCl,10 mM 还原型谷胱甘肽,pH 8.0

注:结合/洗杂缓冲液或者洗脱缓冲液中可加入1-10 mM DTT。


使用方法

注:样品在上样前*用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤,减少杂质以防阻塞柱子。

1样品纯化(以Akta为例)

1)准备:将泵管道中注满去离子水。去掉上塞子,将层析柱连接至色谱系统中。再折断下口,将预装柱接到色谱系统中,并旋紧。

2)清洗:3-5倍柱体积去离子水冲洗层析柱中储存液。

3)平衡:用5倍柱体积的结合Buffer平衡层析柱,使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下,起到保护蛋白的作用。
4)上样:将样品加到平衡好的层析柱中,推荐流速1-5 mL/min,保证目的蛋白与树脂充分接触,提高目的蛋白的回收率,收集流出液,待检测。
注:样品的粘度增加使得即使上样体积很少,也会导致层析柱很大的反压。上样量不要超过柱子的结合能力。大量的样品体积也可能造成很大的反压,使得进样器更难使用。
5)洗杂:用10-15倍柱体积的洗杂Buffer进行清洗,直到紫外吸收达到一个稳定的基线,去除非特异性吸附的杂蛋白,收集洗杂液,待检测。
6)洗脱:用洗脱Buffer 采用一步法或线性梯度洗脱。一步洗脱中,通常5倍柱体积洗脱液足够将目的蛋白洗脱下来。也可以用一个小的梯度,例如20倍柱体积或更多,来分离不同结合强度的蛋白质。
7)清洗及保存:依次使用3倍柱体积的结合Buffer和5倍柱体积的去离子水平衡填料,*再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡,然后保存在等体积的20%的乙醇中,置于4度保存,防止填料被细菌污染。

2 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品(包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等)利用SDS-PAGE进行检测,判定其纯化效果。


3 填料清洗

GST标签蛋白纯化产品可以重复使用而无需再生,但随着非特异结合蛋白的增多和蛋白的聚集,会造成流速和结合载量性能下降,此时需对填料进行清洗。

1)去除一些沉淀或变形物质

用2倍柱体积的6 M盐酸胍溶液进行清洗,然后立即用5倍柱体积的PBS,pH 7.4清洗。

2)去除一些疏水性吸附造成的非特异性吸附物质

用3-4倍柱体积的70%乙醇或2倍柱体积1% Triton X-100清洗,然后立即用5倍柱体积的PBS,pH 7.4清洗。


注意事项

1)请勿冷冻保存本产品。

2)所有操作过程中,样本需要在4℃或冰上操作。

3)为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。


附表 问题及解决方案

问题

可能原因

推荐解决方案

柱子反压过高

填料被堵塞

清洗树脂

裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上样前*用0.22 μm或0.45 μm滤膜过滤,或离心去除

样品太黏稠

样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5 μg/mL),Mg2+(终浓度1 mM),冰上孵育10-15 min

缓冲液太黏稠

有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速

洗脱组分中无目的蛋白

GST标签蛋白变性了

使用温和的裂解条件,实验条件以经验为准

过度的裂解使目的蛋白变性

目的蛋白聚集产生沉淀

在细胞裂解前溶液中加入DTT,终浓度为1-10 mM

融合蛋白改变了GST的构象,影响了目的蛋白的结合力

测定pGEX中GST的结合力,对载体进行超声处理,检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力,有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力

降低结合温度至4℃,充分清洗

柱子平衡时间太短,目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范围内结合

用pH   6.5-pH 8.0的buffer进行充分的平衡,如PBS

目的蛋白没有完全洗脱下来

洗脱体积太少

增加洗脱液体积,减小洗脱流速。

洗脱液中谷胱甘肽浓度太低

增加洗脱液中谷胱甘肽浓度,可尝试用50 mM Tris-HCl,20-40 mM还原型谷胱甘肽pH 8.0洗脱

低pH影响洗脱

在不增加洗脱液中谷胱甘肽量时,提高洗脱液中pH至pH 8-9会有改善

增加洗脱液中离子强度,如0.1-0.2 M NaCl

洗脱液中谷胱甘肽被氧化

使用新鲜配制的洗脱液

加入DTT

非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱

洗脱液中加入非离子型洗涤剂,如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20

电泳或Western   Blot检测中发现多条带

Mr   70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来

Mr   70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物,可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl,2 mM ATP,10 mM MgSO4,pH 7.4在37℃加热10min去除

可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白

GST融合蛋白已经发生降解

在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,如加入1 mM PMSF

可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的,可使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon-或ompT)

细胞破碎过度

减少细胞破碎时间,超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1倍10 mg/mL溶菌酶,25   mM Tris-HCl,pH 8.0),避免发泡导致蛋白酶变性,过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。

共价共纯化

包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化,如:DnaK(Mr~70000),DnaJ(Mr~37000),GrpE(Mr~40000),GroEL(Mr~57000),GroES(Mr~10000)

抗体与E. coli的各种蛋

白反应

抗体吸附E. coli蛋白:GST-抗体;超声处理去除GST抗体,可以用Western Blot检测