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史上最全细胞凋亡检测攻略 2021-06-04

    

近年来,随着对凋亡研究的深入,在细胞凋亡的识别、确认及机制等方面的研究进展显著,用于检测细胞凋亡的新方法不断涌现。细胞凋亡由基因严格控制,包括一系列特征性变化,如核固缩、核碎裂、凋亡小体形成等形态学变化以及DNA特征性片段化、新基因表达、某些生物大分子合成等生物化学变化

细胞凋亡的检测方法正是基于凋亡细胞特殊的形态学改变和生物化学变化而设计的。


1.形态学检测

细胞发生凋亡时会出现一系列独特的形态学变化:

1) 细胞体积变小

2) 核固缩,核仁碎裂,染色质密度增高

3) 胞质浓缩,细胞器密度增高

4) 细胞膜皱褶、卷曲、内陷,并将胞质和DNA分割包裹形成凋亡小体。

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图1. 1:对照组细胞,2-6:分别用不同浓度DHA诱导凋亡后的细胞状态[1]


2.琼脂糖凝胶电泳法

细胞发生凋亡时,Ca2+、Mg2+依赖型核酸内切酶与相关蛋白水解酶被激活,将DNA降解,形成长度为180-200bp或其整倍数的DNA片段。

活细胞DNA:不断裂,凝胶电泳为一正常条带

坏死细胞DNA:随机断裂,凝胶电泳表现为弥漫连续模糊的条带

凋亡细胞DNA:等腰梯形条带

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图2. 泳道2:正常细胞DNA;泳道6:凋亡细胞DNA


3.原位末端标记法TUNEL

末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)可直接催化断裂DNA的3′端的核酸聚合反应,加入带有荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记的核苷酸,显色反应后可特异地进行原位凋亡细胞的检测。正常或增殖细胞几乎没有 DNA 的断裂,故很少被染色。

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图3. YEASEN TUNEL-FITC试剂盒(点击查看产品:CAT.40306)检测凋亡细胞样本


4.Annexin V/PI双染法

细胞凋亡早期, 磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。Annexin V可与 PS 特异性结合,用Annexin V(荧光素或生物素标记)作为荧光探针,并与PI同时使用,借助FCM分析染色情况,其中Annexin V-/PI-、Annexin V+/PI+、Annexin V+/PI-、Annexin V-/PI+分别表示正常、晚期凋亡或坏死、早期凋亡和机械性损伤的细胞。

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图4. YEASEN Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(点击查看产品:CAT.40302)检测细胞凋亡


5.线粒体膜电位变化的检测

处于凋亡早期的细胞,在显微镜下还未出现显著变化时,其膜电位已经开始改变:膜通透性增加,跨膜电位下降。膜电位下降被认为是凋亡最早的步骤,如果膜电位被破坏,则细胞凋亡不可逆转。一些亲脂阳离子荧光染料,如罗丹明123、JC-1等可与线粒体基质紧密结合,细胞聚集染料能力的下降程度与膜电位的下降程度呈正相关

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图5. YEASEN JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(点击查看产品:CAT.40706)检测膜电位变化[3]


6.细胞凋亡的Ca2+浓度变化测定

细胞的生命活动都离不开 Ca2+ ,Ca2+超载时,线粒体通透性转换孔开放,细胞内外Ca2+平衡被破坏,导致细胞凋亡。用 Ca2+特异性荧光探针,如Rhod-2、Indo-1、Fluo-4等对细胞进行标记后,再用 FCM 或荧光、共聚焦激光显微镜检测,可以准确地得出细胞凋亡的生理指标。

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图6. YEASEN Fluo-4, AM,细胞膜可渗透钙离子荧光探针(点击查看产品:CAT.40704[4]


7.细胞周期的测定

细胞周期划分为 G1 期、S 期、G2 期和 M 期,细胞凋亡后发生DNA断裂,用碘化丙啶(PI)、苯基吲哚、吖啶橙等染色剂标记 DNA,通过FCM分析,可以得到细胞各时期的分布状态,可计算出各个时期细胞的比例,以判定细胞凋亡的程度和比率。


8.酶联免疫吸附试验[5]

细胞凋亡时,DNA发生核小体间的断裂,形成由DNA与组蛋白(包含 H、H2A、H2B、H3、H4 五组分)紧密结合的核小体单位的片段。采用双抗体(抗组蛋白抗体和抗DNA抗体)夹心免疫法检测细胞凋亡后形成的核小体,酶催化后形成有色产物,根据颜色反应的深浅定性定量分析细胞的凋亡情况。


9.胱天蛋白酶(caspase)活性检测

caspase-3 被认为是各种因素导致凋亡的关键酶,生理状态下它以酶原的形式存在,它的活化预示着细胞执行凋亡程序的开始,是凋亡进入不可逆阶段的标志。目前,坏死细胞中尚未发现有caspase-3 的活化,因此,通过检测 caspase-3 活力强弱可判断细胞是否凋亡或坏死。


10.细胞凋亡相关基因及其产物的检测

细胞凋亡时某些基因表达异常产物,这些基因转录翻译出来的产物可促进或抑制细胞凋亡,如细胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)及 Fas等。这些相关基因及其表达产物的测定可为细胞凋亡检测提供依据。



YEASEN细胞凋亡检测系列产品

产品名称

货号

规格

Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒

40302ES20/50/60

20T/50T/100T

Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒

40303ES20/50/60

20T/50T/100T

Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 凋亡检测试剂盒

40304ES20/50/60

20T/50T/100T

Annexin V- Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒

40305ES20/50/60

20T/50T/100T

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)

40306ES20/50/60

20T/50T/100T

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 488)

40307ES20/50/60

20T/50T/100T

TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 640)

40308ES20/50/60

20T/50T/100T

Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

40310ES20/50/60

20T/50T/100T

JC-1线粒体膜电位检测试剂盒

40706ES60

100T

JC-10线粒体膜电位检测试剂盒

40752ES60

100T

钙离子探针(Indo-1/ Rhod-2/Fura-2/Fluo-3/Fluo-4)

40775/40776/40702/40703/40704

50ug/5*50ug/1mg



参考文献

[1]李媛媛, 吴洪娟. 双氢青蒿素体外诱导人乳腺癌细胞凋亡的电镜研究[J]. 电子显微学报, 2015(02):138-141.

[2] Suman S,Pandey A, Chandna S. An improved non-enzymatic “DNA ladder assay” for more sensitive and early detection of apoptosis[J]. Cytotechnology, 2012, 64(1):9-14.

[3] Liang W L, Xiao L, Gu H W , et al. Solid lipid nanoparticle induced apoptosis of macrophages via a mitochondrial-dependent pathway in vitro and in vivo[J]. International Journal of Nanomedicine,2019,14:3283-3295.

[4] Fu R, Xia Y, Li M,et al.Pim-1 as a therapeutic target in human lupus nephritis[J]. Arthritis and Rheumatology, 2019, 71(8).

[5]何玉婷,杨雯,王改琴,等. 细胞凋亡主要检测方法及其应用[J].医学综述,2019,25(04):156-160+165.