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避免RNase污染,可以这么做... 2021-12-28

避免RNase污染,可以这么做...

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RNase的来源



? 自然界中许多生物会自主分泌RNase

RNase是生物体的“保护伞”,可防止外源RNA入侵。如:生物眼泪、唾液、汗液等体液中均会分泌RNase。

? 环境中的RNase稳定性非常好

环境中存在的RNase主要是由微生物(细菌和真菌)所分泌,由一种微小紧凑的蛋白组成。它的结构中具有二硫键,因此具有稳定性极强的天然属性,极难灭活,热变性后也可以很快恢复构象。并且,RNase耐热、耐酸、耐碱,因此,它对众多去污方法均具有抵抗作用。

检测RNase污染的小Tips



由于RNase污染而导致实验失败,如何有效检测RNase污染源,是令实验人员头疼的事情。建议从以下几点进行排查:

? 检测缓冲体系、溶液:可启用全新批次的RNase-free试剂测试比对,也可检测疑似污染溶液中的RNase。

? 检测RNA样品:RNase进入RNA样本可在多种情况下发生,如RNA分离时(少量RNase在RNA制备过程中引入),或日常取用时(会不可避免地需要重复开关样品管并插入可能被污染的加样枪头)。

? 可用GAPDH、cyclophilin、或beta-actin等管家基因的探针,通过northern分析来评估poly(A) RNA样品的完整性


从源头开始,避免RNase的污染



RNase的无处不在,使得实验过程中,难以保存RNA样本的完整性。因此,可以从源头入手,一方面要严格控制外源性RNase的污染,另一方面要最大限度地抑制内源性的RNase。

常见的污染源及其控制方法:

外源性


外源性污染源:

体液、水与缓冲液等溶液,枪头,离心管。


控制外源性RNase污染的方法:


操作人员全副武装

在实验过程中戴手套可避免源自人手的RNase污染;触摸皮肤、门把手及普通物体表面后更换手套;

使用专业仪器与试剂

RNA操作专用的移液枪;使用RNase-free的枪头和离心管;使用RNase-free的化合物与试剂;

选择实验操作环境

远离/遮蔽通风孔或开放窗口,走动较少的区域作为RNase-free区域;

其他注意的点

在RNA提取和分析期间,不要进行其他可能引起RNase 污染的实验。



内源性


内源性污染源:

所有组织样品均含有内源性RNase。


抑制内源性RNase活性的方法:


样本保存

组织取样后若不直接提取RNA,要及时用液氮迅速冷冻存于-80°C环境,并尽早进行实验,这样可使RNA的降解达到最少。

添加抑制剂

在细胞裂解液中加入RNase 抑制剂RNase inhibitor,使破碎细胞与灭活RNase 同步进行,最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNase 的活性。

RNase抑制剂可有效避免RNase污染


RNase 抑制剂的类别较多,常用的RNase抑制剂有以下几类:

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关于RNasin



RNasin能够保护mRNA的完整,有利于提高转录及翻译的效率,同时避免了使用有机化合物抑制剂可能带来的影响。

RNasin是从人胎盘或大鼠肝中提取的一种特异的酸性糖蛋白。其分子量为51 kDa,等电点pH值为4.7。RNasin对RNase A、RNase B或RNase C抑制能力极强,可快速特异地与它们以非共价键结合形成1:1的复合物,从而抑制RNase的活性,防止RNA被其降解。但需注意,RNasin不能抑制RNase I、T1、T2、H、U1、U2和CL3的酶活性。

目前,RNasin主要用于cDNA合成,体外转录,体外翻译,以及mRNA-protein复合物分离纯化等过程中保护RNA不被降解;还可用于特定RNase活性的鉴定等。

翌圣生物提供高质量鼠源RNase Inhibitor



翌圣生物科技(上海)股份有限公司(以下简称“翌圣生物”)提供全面、高品质、高性价比的分子酶原料。翌圣生物的鼠源RNase Inhibitor,可用于RT-PCR/RT-qPCR,解决体外转录中RNA降解问题,抑制RNA分离纯化过程中RNase的活性。

产品特点 ?

? 可以抑制RNase A、B和C

? 与 Taq 聚合酶、AMV 或 M-MLV反转录酶兼容

? 与人源RNase inhibitor相比,具有更高的抗氧化活性

? 适合于对高DTT敏感性实验(如RT-qPCR等)

活性定义 ?

抑制5 ng RNase A活性的50%所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。RNase A活性通过水解Cyclic 2’,3’-CMP生成3’-CMP定量求得。

部分案例展示 ?

在相同实验条件下,以qPCR方法分别对翌圣和R*公司的鼠源RNase抑制剂(MRI)的抑制效果进行检测,其结果如下图所示:


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综合以上结果,翌圣鼠源RNase抑制剂能有效抑制体系中的RNaseA,抑制效果优于竞品。

翌圣生物持续致力于开发分子诊断酶原料,并为客户提供相对应的支持,努力为您的工作和公共卫生事业做出贡献。以下为相关产品信息,欢迎来电咨询。

翌圣生物主要分子诊断酶原料



原料类型

描述

产品名称

货号

单酶原料

鼠源RNase抑制剂

Murine RNase Inhibitor (40 U/μL)

10603ES

热启动聚合酶

Hieff UNICON® HotStart Direct Taq DNA Polymerase

10717ES

Taq酶单克隆抗体

Hieff® anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31301ES

Taq酶单克隆双封闭抗体

Hieff® Double-Block anti-Taq DNA Polymerase Antibody

31303ES

第五代耐热逆转录酶

Hifair® V Reverse Transcriptase

11300ES

热敏UDG

Uracil DNA Glycosylase (UDG), heat-labile

10303ES

Bst II DNA聚合酶

Bst II DNA polymerase

12908ES